孙宁老师课题组发现 cTnT 突变诱发扩张型心肌病的分子机理-唯尚立德

复旦大学基础医学院生理与病理生理学系孙宁老师的课题组在Protein & Cell 发表了研究论文 “Isogenichuman pluripotent stem cell disease models reveal ABRA deficiency underliescTnT mutation-induced familial dilated cardiomyopathy”,研究了 ABRA 基因在 cTnT 突变所诱导的家族性扩张型心肌病中所发挥的重要作用。扩张型心肌病(DCM)是一种常见的遗传性心肌病。在过去的几十年中，已经发现编码肌小节、细胞骨架和通道蛋白等的各种基因的单突变与 DCM 相关。然而，肌小节或结构基因中的单个突变是如何导致该疾病产生的机制，目前仍然是并不特别明确的。家族性心肌病中一个常见的现象是，同一基因上的不同单突变有时会导致 DCM 有时又会导致肥厚型心肌病(HCM) 的发生。它们表现出几乎相反的疾病表型 DCM 的特征是心肌和隔膜变薄、心室扩张和收缩功能障碍，而 HCM 表现出心肌和隔膜增厚、心室腔缩小和舒张功能障碍。在细胞水平上 HCM 心肌细胞表现出同心肥大，其特征是肌丝平行组装和肌细胞变宽，相比之下 DCM 心肌细胞却表现出偏心肥大，肌丝串联组装和肌细胞伸长。

编码 cTnT 的基因 TNNT2 是可以明确心肌病表型分支的基因之一。研究发现 TNNT2 的一个等位基因中的赖氨酸 210 (ΔK210)的缺失会导致家族性 DCM 的产生。携带这种杂合突变的患者表现出扩张的心室和收缩功能障碍，从而会导致具有高死亡率的进行性心力衰竭的产生。相反 TNNT2 的一个等位基因中谷氨酸 160 (ΔE160)的缺失会导致 HCM 的发生。先前的研究表明 ΔK210 突变和 ΔE160 突变会导致相反的肌丝对 Ca²⁺ 的敏感性以及力的产生，因此在宏观上就可能会表现出相反的疾病表型。由这两种不同的 cTnT 突变所引起的明显不同的心肌病的表型，为研究人员探索触发 DCM 疾病发展的详细分子基础提供了一个很好的模型。

为了研究这种疾病分化的关键因素，研究人员通过 TALEN 介导的基因编辑技术构建了携带 cTnT-ΔK210 or cTnT-ΔE160 突变的人胚胎干细胞系(hESC)。这排除掉了来自同一家族的个体间的诱导多能干细胞 (iPSC) 间的遗传变异。使用靶向 PGK-Puro 元件的探针所进行的 Southern 印迹实验证实了，在基因组内并没有发生非特异性的整合。对这些细胞系的测序分析进一步对它们的杂合和纯合性进行了验证(图 1 A)。接下来，研究人员将杂合子和纯合子的 cTnT-ΔK210 and -ΔE160hESC 向心肌细胞进行了分化诱导, cTnT-∆K210and -∆E160 hESC-cardiomyocytes 细胞表现出异常的搏动特征(图 1 B)，这表明了这两种突变与心律失常的相关性。为了检查 ∆K210 and ∆E160 突变是否会对肌丝的组装产生影响，研究人员对来源于两种突变 hESC 的心肌细胞中的肌节蛋白 cTnT and α-actinin 进行了免疫染色分析。与 WT hESC-cardiomyocytes 相比 cTnT ΔK210 and -ΔE160的心肌细胞中表现出了不同的肌小节组织的表型(图 1 C)。突变程度相对较低的杂合 TNNT2^WT/^ΔK210心肌细胞就表现出了 DCM 的一些特征标志，例如较少的肌原纤维、更不规则的肌小节组装的破坏以及 cTnT 在细胞内的点状分布，而这些在纯合 TNNT2^{ΔK210/ΔK210}的心肌细胞中更为明显(图 1 D)。通过透射电子显微镜(TEM)对细胞超微结构的分析，可以发现ΔK210 心肌细胞表现出了相对不规则的 Z 线和膨胀的内质网(图 1 E)。相比之下，杂合的TNNT2^WT/^ΔE160心肌细胞则显示出了相对更密集的肌原纤维和加厚的 Z 线，而纯合的 TNNT2^{ΔE160/ΔE160}心肌细胞则显示出了明显被破坏的肌原纤维和 Z 线(图 1 E)。

对于心肌细胞的功能，与 WT 心肌细胞相比，杂合和纯合的 cTnT-ΔK210 心肌细胞都表现出了减弱的相对收缩力，而 cTnT-ΔE160 心肌细胞却表现出了增加的收缩力(图 1 F)。此外 cTnT-∆K210 and -∆E160 心肌细胞在分化后的第 35 天表现出了不同的 Ca²⁺ 的处理特性和更不规则的 Ca²⁺ 瞬变(图 1 G and 1 H)。总体而言，这些结果表明，杂合的 ∆K210 and ∆E160 心肌细胞分别在很大的程度上再现了 DCM and HCM 的细胞表型，而纯合的∆K210 and ∆E160 心肌细胞则表现出了更严重但也异常的细胞表型。

由于 DCM 或 HCM 在患者发病过程中是逐渐的进展的，所以研究人员猜想，参与早期疾病的进展和分化的基因，将是干扰该疾病进展的比较有价值的靶标。在此次的研究中，研究人员使用了∆E160 心肌细胞来作为对照，以寻找在 DCM 的发展过程中参与疾病的早期进展的关键基因。通过使用 RNA 测序技术，研究人员对第 14 天和第 35 天的 ∆K210 and ∆E160心肌细胞来进行了全转录组的测序分析。第 14 天和第 35 天的心肌细胞表现出了非常不同的基因表达的模式，并且可以被自动地分为两大簇(图 1 I and 1 J)，这表明了它们处于不同的发育阶段。在第 35 天的心肌细胞的表达簇内，则开始显示出不同的基因表达的模式，几乎可以被自动地分类为WT, ΔK210 DCM and ΔE160 HCM 组(图 1 I and 1 J)。为了进一步来缩小，与 DCM and HCM 早期疾病进展和分化相关的候选基因的筛选范围，接下来，研究人员比较了在分化后的第 35 天(此时疾病已经产生了分化)的ΔK210 and ΔE160 心肌细胞中的那些差异表达的基因，并重点寻找那些表现出相反表达模式的基因。如(图 1 K), 有 74 个表达模式发生了改变的基因，但其中只有 3 个基因的表达方向发生了反向。在这 3 个基因中 ABRA 在 TNNT2^WT/^ΔK210 DCM 心肌细胞中被下调，而在 TNNT2^WT/^ΔE160 HCM 心肌细胞中被上调。其他两个基因 HRASLS5 and AZGP1 与代谢密切相关，在 TNNT2^WT/^ΔK210 DCM 心肌细胞中表达上调，而在 TNNT2^WT/^ΔE160 HCM 心肌细胞中表达下调(图 1 K 与 ABRA 的模式相反)。这三种基因 ABRA, AZGP1 and HRASLS5 在第 35 天的心肌细胞中的表达模式，通过定量 PCR 又被进一步进行了验证(图 1 L)。由于 ABRA 在患者的骨骼肌肥大中被证明会发生上调而在萎缩中会产生下调，而这与心肌的肥大和扩张密切对应，所以研究人员推测 ABRA 在早期的疾病分化的阶段会有非常重要的作用。

ABRA 是一种心脏和骨骼肌特异性的肌动蛋白的结合蛋白，它特异的定位于 Z 线和 M 线，并直接结合肌动蛋白。先前的研究表明 ABRA 通过促使 MRTF-A and -B 的核易位来激活 Rho 信号通路的传导和血清反应因子(SRF)介导的转录。ABRA 还可以通过增加 G-actin 结合到 F-actin 来促进肌动蛋白的聚合，增强横纹肌细胞的肌丝强度，并调节心脏对应激信号的反应，这表明 ABRA 在这些过程中可能充当了应激传感和细胞内信号调节的细胞骨架中介体的功能。与WT 心肌细胞相比, ABRA 表现出一种条纹状的定位模式，但倾向于定位于 TNNT2^WT/^∆K210细胞的中心，并且在 TNNT2^{∆K210/∆K210}细胞中该模式受到了更大的破坏。在 cTnT-ΔK210 心肌细胞中,ABRA and cTnT 蛋白的水平也发生了降低。而在 cTnT-ΔK210 心肌细胞中使用慢病毒来过表达 ABRA 能挽救与 DCM 相关的细胞表型，例如肌小节解体, cTnT 的点状分布和收缩力降低。因此，研究人员推断 cTnT-ΔK210 心肌细胞中ABRA 的下调减少了 F-actin 的形成，并可能直接削弱了肌丝的结构，从而导致了细胞收缩性的降低和 DCM 相关表型的产生。

图1

研究人员接下来研究了，在心脏特异性的表达 ABRA 是否可以在体内逆转 cTnT-ΔK210 DCM 小鼠的疾病表型。结果显示 cTnT-ΔK210 小鼠中 ABRA蛋白减少。在 cTnT-ΔK210 小鼠中用 α-actinin 来染 Z 线及用TMOD1 来染 A 带，结果进一步表明了 Z 线是相对完整的，但 A 带受到了破坏。接着，构建了由在心脏中特异性表达的 cTnT 启动子所驱动的 ABRA 表达的腺相关病毒载体(AAV9-ABRA)，并同时构建了 cTnT 启动子驱动荧光素酶表达的 AAV9-Luci 载体来作为对照。在小鼠出生后的第 2-3 天通过腹腔注射的方式来导入 AAV 表达载体。而仅在心脏中检测到了荧光素酶蛋白的表达，这验证了病毒的有效性。

图2

本研究中所使用的 cTnT-K210 knock-in 小鼠由北京唯尚立德提供，该小鼠在 Balb/c 的背景下通过 TALEN 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验，已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型，同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台，欢迎您致电咨询。

原文链接：https://doi.org/10.1007/s13238-021-00843-w

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