山东大学附属济南市中心医院肿瘤科的孙玉萍教授团队在杂志 Theranostics (IF=10.849) 上发表文章《ILT4 inhibition prevents TAM- and dysfunctional T cell-mediated immunosuppression and enhances the efficacy of anti-PD-L1 therapy in NSCLC with EGFR activation 》。

针对 PD-1/PD-L1 通路的免疫检查点抑制剂 (ICI) 在非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中的治疗成功率有限，尤其是在那些具有激活性表皮生长因子受体 (EGFR) 突变的患者中。因此，迫切需要阐明 EGFR 介导的肿瘤免疫逃逸的机制和开发有效的免疫疗法。该项研究利用 mRNA 芯片和 TCGA 数据库以及 WB 验证等方法，分析得出 EGFR 可以调节 ILT4 表达的分子机制；通过细胞增殖和凋亡等实验，分析得出 ILT4 对肿瘤细胞的增殖和凋亡具有调节作用；通过 Transwell 迁移和流式细胞检测等方法，对 ILT4 and PD-L1 对肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的募集和极化的影响进行了分析；通过 CFSE 增殖和细胞凋亡等实验，分析了 ILT4 and PD-L1 对 T 细胞的存活和细胞毒性的影响；研究发现在 NSCLC 细胞中被激活的 EGFR-AKT and ERK1/2 信号通路可诱导 ILT4 的表达。过表达的 ILT4 通过招募 M2 样的肿瘤相关巨噬细胞(M2-like TAMs)和破坏 T 细胞的反应来抑制对肿瘤的免疫反应；而对 ILT4 的抑制可以防止免疫抑制的产生并且阻止肿瘤的进展。这一研究结果为增进对 EGFR 介导的肿瘤免疫逃逸新机制的了解提供了帮助，并为 EGFR 激活型的 NSCLC 患者的免疫治疗提供了新的策略。北京唯尚立德有幸为该研究提供了免疫缺陷性的 NVSG 小鼠，为能够对科研人员对肿瘤的进展和治疗的研究提供一定的助力而深感荣幸。

研究人员首先通过 IHC， qPCR， WB 等方法确定了在 NSCLC 细胞中活化的 EGFR 可诱导 ILT4 的表达。

为了进一步研究 EGFR 诱导 ILT4 表达的分子机制，研究人员通过 mRNA 芯片和 TCGA 数据库数据挖掘以及 WB 验证等方法，研究证明活化的 EGFR 是通过激活的 ERK and AKT 信号通路来诱导 ILT4 的表达的。

为了进一步研究 ILT4 在 EGFR 激活的 NSCLC 发病机制中的作用，研究人员通过基因敲除和生物信息学研究等方式，通过免疫组化、细胞迁移、ELISA、细胞增殖和流式细胞等实验方法，表明激活的 EGFR 在肿瘤细胞中通过 ILT4 来促进肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的募集和 M2 样的极化的(M2-like polarization)。

由于通过 TCGA 的数据分析表明 ILT4 的表达与 T 细胞的浸润反应呈现显著的相关性，因此研究人员通过免疫组化、细胞增殖、细胞凋亡和细胞溶解等实验方法，研究发现在肿瘤细胞中激活的 EGFR 所诱导的 ILT4 的表达会损害 T 细胞的增殖以及减弱 T 细胞的细胞毒性反应。

通过上面的研究，结果表明在 EGFR 激活型的肿瘤细胞中 ILT4 是通过对 M2 样的 TAM 的募集和对 T 细胞存活和细胞毒性的抑制来介导免疫抑制的。因此，研究人员继续探讨了对 ILT4 的阻断对免疫检查点抑制剂(ICI)疗效的影响。通过细胞迁移、ELISA、qPCR、流式细胞等实验方法，研究发现在 EGFR 激活型的 NSCLC 细胞中通过对 ILT4 和 PD-L1 的联合阻断可以协同改善 TAM 和功能失调的 T 细胞所介导的免疫抑制反应。

由于前面的体外研究的结果表明对 ILT4 的阻断可以显著的削弱免疫抑制的作用并增强 PD-L1 抑制剂的抗肿瘤效果。因此，接下来研究人员探讨了 ILT4 和 PD-L1 的联合治疗在体内是否依然具有控制肿瘤进展、巨噬细胞(M2-like TAMs)浸润和 T 细胞功能障碍的协同作用。通过野生型(WT)和免疫缺陷型(NVSG)两种小鼠模型来进行肿瘤药效的研究，结果表明在体内对 PIR-B(小鼠中的人 ILT4 的直系同源基因)和 PD-L1 的阻断可以协同阻止肿瘤的生长和免疫逃逸反应。

由于对具有 TKI 耐药性的 EGFR 突变的 NSCLC 患者来说，免疫治疗是另外一种主要的治疗途径，因此在临床上 ICI 的耐药依然是目前一个比较棘手的挑战。所以接下来研究人员对阻断 ILT4 对 ICI 耐药性所可能产生的影响来进行了研究。通过在 NVSG 小鼠中来重构免疫治疗的模型，研究发现对 ILT4 的阻断在体内抑制了 EGFR 突变所导致的 TKI 耐药的 NSCLC 肿瘤的进展和免疫逃逸反应。结果表明，对 ILT4 的阻断可能是对 EGFR-TKI 治疗产生耐药的 EGFR 突变患者的一个有效的治疗策略。

又因为在大多数的临床试验中 ICI 治疗已被应用于对 EFGR 未突变的 NSCLC 患者来进行治疗，但治疗的效果表明，大多数的患者对 ICI 治疗并不太敏感。因此，研究人员接下来对 ILT4 和 PD-L1的联合治疗在体内对 EGFR 野生型的 NSCLC 肿瘤的 ICI 治疗的疗效来进行了研究，通过使用 NVSG 小鼠来建立重构的免疫治疗的小鼠模型的方法，研究发现阻断 ILT4 可以显著的增强 PD-L1 抑制剂在体内对 EGFR 未突变的 NSCLC 肿瘤的疗效。

本研究所用 NSG(NVSG) 免疫缺陷小鼠由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。本公司成立于 2011 年 3 月，是由来自北京大学、中国医学科学院的科研团队产业转化而来的国家高新技术企业，也是国内第一家提供基因编辑技术服务的公司，拥有丰富、成熟的基因编辑动物构建经验。此外，本公司也可提供动物繁育、动物实验和数据分析等一站式服务。为广大科研工作者的科学研究工作保驾护航。

原文链接：https://dx.doi.org/10.7150%2Fthno.52435

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