基因敲除细胞系构建服务
预试验：（一个月）
1、细胞的转染效率：尝试各种转染方法，如Lipo2000、LTX、电转等，以期找到转染效率相对高的方式。
2、药筛浓度检测：如果转染效率不高，而过流式对细胞损伤很大，需要做抗性筛选，检测出杀死细胞的筛选药物的最小浓度。
3、单克隆培养情况：观察细胞是否可以单克隆培养，起码需要两周时间培养才能检测单克隆培养周期。这个周期很大程度影响了细胞的检测周期。
4、细胞中目标基因存在多个拷贝，这样的敲除将大大增加了工作的难度。
问题与分析：
一、敲除的不确定性：
1、设计多个靶点都没有内源活性，可能是切割区域内存在染色质复杂结构，建议换一个新的区域。（参考文献NAR，2014年
2、筛选一轮需要检测100-200个单克隆细胞，约一个月时间。要拿到纯合子一般需要多轮筛选
二、致死基因的敲除风险：
1、致死：如细胞周期调控基因、House keeping基因等，敲除后有可能导致细胞死亡或者状态不佳。因此无法获得纯合子的细胞株。
2、关键基因：这些基因的敲除有可能导致细胞的生长状态不佳。
3、其他：少数基因获得纯合子后，在增殖过程中，生长状态会变的越来越差，最终导致无法运输。
敲除方案：
步骤 | 服务内容 | 配套产品 |
预试验 | 详见上面 |
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选择打靶技术 | TALEN（优先） | CRISPR/CAS9（有脱靶风险） |
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设计靶点 | 一般在不同转录产物的共同外显子上设计9个靶点，靶点位置尽量在基因CDS的前1/3，ATG之后，不在最后一个exon上，最好能破坏重要的domain和所有的转录产物isoform。第一批合成3个，时间紧的可一次上6个甚至9个 |
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选择打靶载体 | 转染效率低的选择带荧光或药筛标记的载体 | e-TALEN构建试剂盒、CAS9构建试剂盒 |
内源活性初步验证 | 转染细胞，72h后提基因组，在靶点左右两边设计合适引物（建议一边250bp，另外一边150bp，也可以两边长度相同）。分两组：突变型的细胞和野生型细胞，PCR产物要单一，PCR产物的长度400-500bp。然后胶回收PCR产物，定量，分别取等量的突变型和野生型PCR产物自然退火杂交，用T7E1酶切并跑胶检测，如果野生型没有杂带，而突变型出现杂带，则证明打靶质粒是有活性的，突变比例可以通过定量条带亮度来估算。 | T7E1酶 |
内源活性测序鉴定 | 将前面的野生型和突变型PCR产物送测序，通过测序图谱来进一步确认是否发生突变，主要查看测序的峰形图，在靶点位置附近是否开始出现杂峰。 |
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单克隆筛选 | 无限稀释到每孔1个细胞的数量，每株细胞铺至少4个96孔板。细胞长好后，一部分送去做单克隆细胞的基因型鉴定，剩下继续扩大培养或者冻存。基因型鉴定参考内源活性初步验证和测序鉴定的方式。 |
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获得突变型 | 扩增至10的五次方，冻存多管 |
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