大鼠球囊损伤实验

1.   实验目的与背景

动脉粥样硬化(atherosclerosis.AS)是危害人类健康的一类疾病，是导致人类死亡的头号杀手，因此，国内外医学界对AS关注程度也日益增长。长期以来，国内外学者对AS的发病机制进行研究，学说甚多，但确切病因尚未完全闸明。传统的学说如脂质渗入学说、血栓源学说、中层平滑肌细胞增生学说、巨噬细胞受体缺失学说、血流动力学学说、内皮细胞损伤学说及损伤应答和炎症学说等，其中任意一种学说均不能全面解释AS的发生与发展。AS发病机制和治疗对策的探究成了医学研究的热点。选择合适的动物成功建立动物模型是研究AS发病机制及探讨治疗措施的重要条件。因此。在本模型的建立过程中，力求更贴切的模拟临床病变，为AS发病机制探讨和治疗方法的改进研究提供与临床病例最为相似的实验对象。

背景：

AS是一种全身性疾病，主要累及大中动脉，基本病变是动脉内膜的脂质沉积、内膜灶状纤维化及平滑肌细胞和结缘组织增生，引起内膜灶性纤维性增厚及粥样班块形成，使动脉壁变硬，管腔狭窄，并引起继发性病变，特别是心、脑血管等器官的缺血性病变。动脉内膜损伤是促使AS形成的最重要危险因素，所以可以用机械性损伤动脉内膜联合高脂饮食来建立AS模型。目前报道的机械性内膜损伤方法有两种：球囊损伤术及空气干燥术。球囊损伤术主要造成内皮细胞的即刻剥脱。弹力板及中膜严重损伤。

2.实验材料

2.1动物：

表3  实验动物信息

2.2主要试剂、耗材：

眼科剪，眼科镊，手术剪，辅料镊，手术缝合线，缝合针，止血钳，止血夹，持针器，2mm球囊，大鼠手术台，棉签，纱布块，注射器，碘酒棉球，酒精棉球。

2.3主要仪器：

显微镜

冷光源

3实验方法

3.1术前准备

1.术前准备：选择键康大鼠作为实验对象，手术器械和敷料均经过121℃，60min高压灭菌，球囊采取75%酒精消毒。

2.自制拉钩：将回形针一端和橡皮筋钩在一起并固定。回形针另一端做45度弯曲，用于钩挂组织，将橡皮筋另一端以蛙钉置定在手术台上。可以任意调节蛙钉位置而改变牵拉的力度。

3.麻醉。大鼠腹腔注射5ml（10%三溴乙醇）麻药。

4.抗感染、消毒 。术前、术后常规腹腔给予4×104U庆大霉素及颈部皮肤消毒。

5.扩大手术视野。颈正中切开皮肤，分离皮下组织与肌肉。

6.游离和结扎血管。充分游离颈总动脉、颈内外动脉，永久结扎颈外动脉后远心端，颈内动脉，颈总动脉近心端临时结扎，可以阻断血流，防止颈外动脉切口处大出血。

7.拖伤内膜，建立模型。阻断血流后，于颈外动脉近端剪开一切口，插入 2F 球囊导管至颈总动脉远端。注入 200 μL 生理盐水使球囊膨胀，来回拉球囊至颈内动脉与颈外动脉交叉处，抽出生理盐水，重新插入导管，重复上述操作 3 次后拔出导管，结扎颈外动脉并缝合。手术局部使用青霉素以防止感染。

3.2具体操作步骤

1.把大鼠麻醉后用胶带固定在手术台上，根据颈总动脉搏动确定颈总动脉的位置，沿颈总动脉走行纵向切开皮肤。

2.用弯止血镊纯性分离组织，并以自制拉钩牵拉开皮层和基层，使颈动脉充分暴露，改用显微镊挑开分离出颈动脉。分离长度大约2-3cm，分离时动作要轻柔，用棉签来回轻轻剐蹭，不得用刀剪等锐利器械，以防止损伤血管和神经，特别在分离神经时动作不仅要轻，而且不能大幅度牵拉，以避免对大鼠产生较大的刺激。

3.结扎颈总动脉前先穿三根手术线备用，选择4-0号手术缝合线做结扎。结扎颈总动脉的近心端，结尽量打牢。防止插入球囊时脱落。

4.提起颈总动脉，分离出颈内外动脉(图1)，用止血夹夹住颈内动脉，以阻断动脉血流为止，然后用止血钳夹住一备线两端，结扎颈外动脉近头端（距离分叉5mm处）使颈总动脉血流保持被阻断状态（图2）。

5.球囊选择直径2mm的，排出空气。并且减小球囊体积，以利于进入颈总动脉。

6.拉起颈外动脉远心端打结的缝合线，用眼科镊向心方向剪一“V”型口，注意不要把颈外动脉剪断，剪开部分不要超过颈总动脉直径的1/2，最好控制在1/3左右。

7.“V“型口剪好后，迅速将处理过的球囊尖端插入颈总动脉，再以左手提起远心端的结扎线，右手稍稍用力向前推进，遇阻力则稍稍反向牵拉，重新向心插入，在球囊进入2-3cm处（图3）。

8.用球囊自带注射器连接球囊导管端，注入生理盐水 200 μL ，使球囊膨大，然后向后牵拉球囊末端，用力多拉出1cm左右，然后回抽注射器液体，再重新向心插入球囊，重复上述步骤，如此反复2-3次（图4）。（注意：每次插入拔出球囊，近心端松紧需要控制好，不然出血无法控制）

9.最后把球囊中的液体抽出，然后缓慢拉出球囊，并及时拉紧颈外动脉近心端的备线，结扎近心端（分叉处）。剪掉结扎点多余的缝合线，放开颈内动脉止血夹，颈总动脉结扎线，恢复血流，颈总保持搏动（图5），肌肉恢复原位，缝合皮层，做消毒处理即可。

4.模型检测

4.1血常规病理检测

4.2取材颈动脉

注意事项：

6.1球囊导管直径选择：大鼠：2.0mm，此种直径最为合适，当然实验动物的大小也有一定要求，大鼠一般选择250g左右。

6.2用眼科剪剪开血管后，要趁血液流出的那一刻迅速将球囊插入血管，否则需要期直眼科镊轻轻犹庭新口。再把球囊插入。

6.3球囊达到颈总动脉中段后，反复牵拉时，用力一定要轻，以防拉断颈主动脉的细小分支，而竟移腔内出血，动物意外死亡。