多基因片段快速拼接克隆试剂盒

产品组成：

注意：收到试剂盒后，使用前请离心，避免液体滞留在离心管盖、管壁上。

保存条件：-80℃ 保存一年；或 -20℃ 保存两个月。请将产品于 -80℃ 保存，避免反复冻融。

Easy Assembly反应示意图：

Easy Assembly 通过体外重组方法一步完成多个(2-6 个) DNA 片段无缝拼接连接(见下图)。Easy Assembly 是一种新颖的分子克隆方法，不需要传统克隆方式的酶切连接，仅需要 15-70bp（建议 50bp）的同源接头，并可以随意修改接头部位的序列，使得 DNA 克隆方便

快捷，连接更加精确，且反应时间短。

Easy Assembly 的优势：

1/ 实现多个 DNA 片段同时拼接

2/ 拼接 DNA 片段大小范围宽(260bp-10Kbp)，实现大片段 DNA 的克隆

3/ 试验操作简单，避免了 DNA 酶切、回收、连接等分子克隆操作，操作时间大大缩短，约半小时可完成反应

4/ 反应效率高

适用范围：

1/ 载体≤15k; 连接片段长度 260bp-10Kbp; 连接 DNA 片段数目≤10

2/ 接头长度：15-70bp, 40-50bp 最佳

3/ DNA 片段推荐浓度：0.002-0.010pmol/片段

4/ 浓度计算：pmol=DNA 质量(ng)×1000/(碱基对数目×650D)。例如，50ng 5kb 的双链 DNA 为 0.015pmol

实验步骤：

1/ 分别通过 PCR 或者酶切准备进行拼接的 DNA 片段，定量。

2/ 取一支 easy Assembly mix 离心，避免液体残余管盖、管壁上，放置在冰上。

3/ 将各个 DNA 片段按等摩尔量混合，取总量 2.5μl 的 DNA 片段，加入到一支 easy Assembly mix 管中，混匀。

4/ 立即置于 50℃（可在 PCR 仪上进行），反应 30min-60min 后，然后进行 DNA 的 E.coli 转化，复苏，涂板。

注意事项：

1/ 加入的 DNA 片段应为等摩尔量。

2/ 加样过程于 4℃ 操作。

3/ 当出现下列情况建议使用 2 倍反应体系：连接 DNA 片段多于 5 段，或者单片段长度大于 6k, 接头长度小于 15bp 或大于 50bp, 反应片段摩尔量低于 0.0002pmol.

4/ 若接头大于 70bp, 建议适当延长反应时间。

5/ 多片段反应时，接头应避免出现重复序列，或者拼接片段中除接头外尽量不要再有接头序列，由于反应原理是体外同源重组，将可能出现这些同源序列的意外拼接。

6/ 建议使用 DH5α 感受态细胞进行转化。

7/ 建议转化后复苏 45min-1h.

同源接头设计例子：

下面序列是需要拼接的相邻 DNA 序列，分别用红色字体与黑色字体标示。所以接头的同源序列就直接取红色与黑色字体的交接处的 DNA 序列：

GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCACTCTGTGGCACTTTCCAATTTCAGACTCTGATCCGGACACT

CTTACAGGGNNNNNNNATGCTGGAGAAGTTCTGCAACTCTACTTTTTGGAATTCCTCATTCCTGGACAGTCCGGAGGCAGACCTGCCACTTTGTTTT

GAGCAAACTGTTCTGGTGTGGATTCCCTTGGGCTTCCTATGGCTCCTGGCCCCCTGGCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTC

TACCACCAAACTCTATCTTGCTAAGCAGGTATTCGTTGGTTTTCTTCTTATTCTAGCAGCCATAGAGCTGGCCCTTGTACTCACAGAAGACTCTGGAC

AAGCCACAGTCCCTGCTGTTCGANNNNNNNNNNTGATCTTTTCAGCATTTTCAGAAAATAATGAGT

CATCAAATAATCCATCA

因此，接头同源序列可以加在引物上，如下：

片段 1 正向引物：根据上一段拼接的序列而定

片段 1 反向引物：

TGGTGGTAGAGGATCTCTTGGTCCTGGATTTATACACGTGGAGAAGCTGC

片段 2 正向引物：

GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCA

片段 2 反向引物：根据下一段拼接的序列而定

片段 1 和片段 2 的 PCR 产物，再加上其他 DNA 片段将可以通过 Easy Assembly Cloning Kit 无缝拼接在一起了。