miRNA 研究全套解决方案

      北京唯尚立德公司拥有人类miRNA mimics 及antagomir文库（1000×2），小鼠miRNA mimics及antagomir文库（600×2），大鼠miRNA mimics及antagomir文库（500×2）。这些文库可以应用于大规模高通量筛选，助力广大科研同仁系统、高效的研究功能，完成项目。

服务内容：

情景一：鉴定miRNA的靶基因
一、萤光素酶（Luciferase）双萤光报告基因实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述：
构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因，与miRNA mimics共转到细胞当中，通过荧光素酶活性检测，即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用，可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验，也可高通量筛选。
原理图：

b、步骤流程：
1.预测miRNA的靶基因及靶位点
协助客户利用Targetscan，Pictar，miRNA.org，RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。

2.miRNA靶点鉴定

ii、Luciferase报告基因构建：
  将目的片段组装到报告基因载体，1周，800/个。
   iii、miRNA表达载体构建：
  2周，可以扩增用于其他实验，800/个。
  推荐：miRNA mimics合成：1-2周，2 OD，赠送阴性对照，400/个。（二选一）
   iv、Luciferase实验：
  每个靶点都要做一个对照；每个样品包含内参和三组重复，根据样品数而定周期，400*2/个靶点。

成功实例：

图 1-2

二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述：
对于前面有效果的miRNA靶基因，将miRNA的binding位点，尤其是seed区突变掉，造成miRNA无法结合，检测luciferase信号是否恢复。原理图：（如图1-1）
b、步骤及流程
   1.Luciferase报告基因构建：PCR法，每段突变20个碱基之内，1-2周
   2.Luciferase实验：每个样品包含内参和三组重复，根据样品数而定周期。

成功实例：

图 1-3

三、mRNA水平鉴定miRNA靶点
  a、实验目的：由于miRNA作用机制有两个方面，降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平，所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据，用于分析miRNA作用靶点基因的机制。
  b、实验概述：对于前面有效果的miRNA靶基因，检测mRNA水平是否被miRNA下调。
  c、具体内容：将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中，48-72小时候，提取RNA，荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。900/个靶点+900/对照，2个靶点起订。

四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点
  a、实验目的：由于miRNA作用机制有两个方面，降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平，所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据，能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化，结合mRNA表达水平变化，有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。
  b、实验概述：对于前面有效果的miRNA靶基因，检测蛋白水平是否被miRNA下调。
Western Blot实验：每个样品包含内参，客户提供一抗。
  c、具体内容： 将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中，48-72小时后，裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照，2个靶点起订。
成功实例：

图 1-4

五、使用靶基因的siRNA验证靶点
实验概述：
  miRNA过表达会引起细胞表型的变化，例如迁移、增殖、凋亡，以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化，可以使用靶基因的siRNA，检测是否会引起同样的变化。
详见基因沉默服务内容。

六、使用miRNA的抑制剂（Antagomir）验证靶点
  原理：miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。
  优势：与普通抑制剂相比，miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果，且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。（Antagomir的合成：单链的特殊修饰的RNA，2 OD）
  实验概述：对于内源有表达的miRNA，可以使用Antagomir，检测靶蛋白表达量是否恢复，检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA，可以先构建miRNA稳定表达细胞系，再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。

七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点
  实验概述：对于内源有表达的miRNA，可以构建cDNA表达质粒，过表达靶蛋白，检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA，可以构建miRNA稳定表达细胞系，再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。

八、miRNA靶基因信号通路总结
概述：利用prePPI,KEGG等生物信息学软件，总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。
成功实例：

图 1-5

情景二：已知现象，未知miRNA，发现您感兴趣的miRNA
内容：利用高通量筛选手段，针对您感兴趣的现象或者细胞行为，筛选出与此相关的miRNA。
详情见高通量筛选服务内容。

情景三：已知基因，鉴定调控它的miRNA
内容：构建包含目的基因3’UTR的luciferase报告基因，与候选miRNA mimics共转到细胞当中，通过荧光素酶活性检测，即可分析出miRNA对目的基因的调控作用，既可以小规模实验，也可高通量筛选。