对病毒基因组的系统性扫描揭示了大量潜在的基于CRISPR的基因组编辑工具。CRISPR-Cas系统在细菌和古生菌的微生物世界中很常见，它们经常帮助它们的宿主细胞抵御病毒。但是，在一项新的研究中，来自美国加州大学洛杉矶分校的研究人员发现在公开的可感染这些微生物的病毒（称为噬菌体）的基因组序列中，CRISPR-Cas系统占0.4%。他们认为，这些病毒利用CRISPR-Cas彼此竞争---而且有可能也是为了操纵宿主的基因活性，使之对自己有利。相关研究结果发表在2022年11月23日的Cell期刊上，论文标题为“Diverse virus-encoded CRISPR-Cas systems include streamlined genome editors”。

其中的一些病毒CRISPR-Cas系统能够编辑植物和哺乳动物的基因组，并且拥有一些特征---比如紧凑的结构和高效的编辑---这可能使它们在实验室中发挥作用。

美国国家生物技术信息中心计算生物学家Kira Makarova说，“这是在发现CRISPR-Cas系统的巨大多样性方面迈出的重要一步。这里发现了很多新奇的东西。”

切割DNA的防御措施

尽管CRISPR-Cas最为人所知的是在实验室中用作一种改变基因组的工具，但是它在自然界中可以作为一种初级的免疫系统发挥作用。大约40%抽样的细菌和85%抽样的古生菌都有CRISPR-Cas系统。通常，这些微生物可以捕获入侵病毒的基因组片段，并将这些片段储存在它们自己基因组的一个称为CRISPR阵列（CRISPR array）的区域。CRISPR阵列随后作为模板生成向导RNA（gRNA）用于指导CRISPR相关（CRISPR-associated, Cas）酶切割相应的DNA。这可以让携带CRISPR阵列的微生物切割病毒基因组，并有可能阻止病毒感染。

微生物中发现大量类似CRISPR的基因切割酶

病毒有时会获取其宿主的基因组片段，而且科学家们以前已在病毒基因组中发现过CRISPR-Cas。如果这些偷来的DNA片段给病毒带来了竞争优势，那么它们可以被保留下来并逐渐地经历修改，以便更好地为病毒的生活方式服务。比如，一种感染霍乱弧菌的病毒利用CRISPR-Cas切割细菌DNA中编码细菌中编码抗病毒防御的DNA并使之失活（Nature, 2013, doi:10.1038/ nature11927）。

在这项新的研究中，加州大学伯克利分校的分子生物学家Jennifer Doudna和微生物学家Jillian Banfield及其同事们决定在感染细菌和古生菌的病毒（即噬菌体）中更全面地寻找CRISPR-Cas系统。令他们吃惊的是，他们发现了大约6000种编码CRISPR-Cas系统的噬菌体，包括每一种已知类型的CRISPR-Cas系统的代表。Doudna说，“有证据表明，这些CRISPR-Cas系统是对噬菌体有用的系统。”

这些作者发现了在通常的CRISPR-Cas结构上存在着广泛的变异，一些CRISPR-Cas系统缺少组分，另一些CRISPR-Cas则异常紧凑。在法国国家科学研究中心研究噬菌体生态学和进化的Anne Chevallereau说，“即使噬菌体编码的CRISPR-Cas系统是罕见的，它们也是高度多样化和广泛分布的。大自然充满了惊喜。”

小而高效

病毒基因组往往是紧凑的，而且一些病毒的Cas酶非常小。这可以为基因组编辑应用提供一个特别的优势，因为较小的酶更容易穿梭于细胞中。Doudna和她的同事们专注于一类特定的称为Casλ的小型Cas酶，并发现其中的Casλ可被用于编辑实验室培养的来自拟南芥和小麦的细胞以及人类肾脏细胞的基因组。

这些结果表明病毒Cas酶有潜力加入在微生物中发现的越来越多的基因编辑工具的行列。Doudna说，尽管科学家们已在自然界中发现了其他小型Cas酶，但迄今为止，其中的许多小型Cas酶在基因组编辑应用中的效率相对较低。相比之下，一些病毒Casλ酶兼具小尺寸和高效率。

与此同时，科学家们将继续搜索微生物，以寻找对已知CRISPR-Cas系统的潜在改进。Makarova预计科学家们还将寻找被质粒---可以从微生物之间转移的DNA分子 ---拾取的CRISPR-Cas系统。

她说，“每年我们都有数以千计的新基因组出现，而其中的一些基因组来自非常不同的环境。因此，这真地会很有趣。”

在一项新的临床研究中，来自英国大奥蒙德街儿童医院和伦敦大学学院的研究人员利用CRISPR/Cas9技术对供者T细胞进行基因改造，试图治疗患有耐药性白血病的重症儿童，这些儿童已用尽所有可用的治疗方法。这项I期临床试验是首次在人类身上使用“通用的”经过CRISPR基因编辑的T细胞，代表着在使用基因编辑细胞治疗癌症方面迈出了重要一步。作为这项临床试验的一部分，他们构建并应用了新一代的更精确的“通用”基因组编辑T细胞。相关研究结果发表在2022年10月26日的Science Translational Medicine期刊上，论文标题为“Phase 1 clinical trial of CRISPR-engineered CAR19 universal T cells for treatment of children with refractory B cell leukemia”。

这些作者使用CRISPR对T细胞进行了基因修饰，具体而言它对T细胞的DNA进行切割并插入了一段遗传代码。在这种情况下，这段遗传代码允许T细胞表达一种识别癌变B细胞表面上的一种称为CD19的标志物的嵌合抗原受体（CAR），所产生的CD19CAR-T细胞摧毁这些癌变B细胞。他们随后利用CRISPR破坏了CD19 CAR-T细胞中的T细胞受体α链并移除它们的CD52，由此获得TT52CAR19 T细胞，这样构建出一种通用的可以“现成”使用的CAR-T细胞疗法，而无需任何供者匹配。

虽然英国国家医疗服务体系如今提供了一些CAR-T细胞疗法，但它们依赖于收集患者自身的T细胞并对它们进行基因改造。这很昂贵，并不总是可行的，也不可能在短时间内实现。目前正在研究基因组编辑，以允许供者提供的T细胞经过预先制造后用于多名患者，目的是降低成本，使得它们更容易获得。

在大奥蒙德街儿童医院的专业洁净室里，科学家们使用一种失活病毒来转移CAR和CRISPR指导系统，制造他们的供者CAR-T细胞库，然后应用前沿的mRNA技术来激活基因编辑步骤。供者都是来自英国的健康志愿者，由安东尼-诺兰登记处（Anthony Nolan Registry）提供。

这项临床试验

六名年龄在14个月至11岁的复发性和治疗抵抗性的B-ALL儿童在2022年2月之前已接受了治疗。所有这些儿童以前都接受过英国对B-ALL的标准治疗，但不幸的是，他们的疾病多次复发。

患者接受了预计将在四周左右具有活性的TT52CAR19 T细胞。这段时间足够达到深度缓解，也就是癌症显著减少或无法检测的状态。一旦取得成功，患者就有资格进行骨髓造血干细胞移植，以帮助重建健康的免疫系统。

在首批接受TT52CAR19 T细胞治疗的6名儿童中，有4人在28天内进入缓解期，这使他们能够接受造血干细胞移植。在这4名儿童中，2人分别在治疗后9个月和18个月内仍在持续缓解，而不幸的是，另外2人在造血干细胞移植后复发了。在这项新的临床研究中，整体的副作用在预期之内，并在医院得到控制，有1名儿童需要短期的重症监护。

论文通讯作者、大奥蒙德街儿童医院免疫学顾问Waseem Qasim教授说，“虽然这种无反应的白血病非常罕见，但是我们很高兴能够为一些最难治疗的儿童白血病带来新疗法，尤其是当所有其他治疗选择都已用尽时。虽然还有一些挑战需要克服，但这项新的研究是一个很有希望的证明，说明新兴的基因组编辑技术可以用来解决我们看到的一些病情最严重的儿童的未满足的健康需求。”

论文共同作者、大奥蒙德街儿童医院血液学顾问和白血病专家Ajay Vora教授说，“这项新研究中接受治疗的儿童面临着最糟糕的疾病预后。我们只有通过临床试验才能拯救更多年轻的生命，我们永远感谢所有参与这项研究的家庭，这将在未来帮助更多的孩子。”

论文共同作者、大奥蒙德街儿童医院骨髓移植顾问Kanchan Rao博士说，“这项新的研究增加了越来越多的证据，表明经过基因组编辑的T细胞可以成为目前可用治疗方法的可行替代方案。虽然这并不是在所有情况下都能成功，但对于这项新研究中的一些儿童来说，它已经拯救了生命。”

下一步，这些作者将在更多儿童的治疗过程中，在他们的癌症还没有进展的时候，为他们提供这种治疗。

CRISPR-Cas9基因编辑系统的一种新变体使得它更容易为治疗应用而对大量细胞进行基因改造。美国格拉斯通研究所和加州大学旧金山分校开发的这种方法让科学家们能够以非常高的效率将特别长的DNA序列引入细胞基因组的精确位置，而不需要传统上用来携带DNA进入细胞的病毒递送系统。相关研究结果于2022年8月25日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails”。

论文共同通讯作者Alexander Marson博士说，“多年来，我们的目标之一是以一种不依赖病毒载体的方式将冗长的DNA指令引入基因组中的靶位点上。这是迈向下一代安全和有效的细胞疗法的一大步。”

在这篇论文中，Marson和他的同事们不仅描述了这项技术，还展示了它如何被用来构建具有抗击多发性骨髓瘤（一种血癌）潜力的CAR-T细胞，以及改写发生突变后可能导致罕见的遗传性免疫疾病的基因序列。

论文共同通讯作者、Marson实验室临床研究员Brian Shy博士说，“我们发现我们可以在一次运行中对超过10亿个细胞进行基因改造，这远远超过了我们治疗一名患者所需的细胞数量。”

从双链DNA到单链DNA

CRISPR-Cas9是一种在活细胞内进行基因编辑的系统，在过去十年中一直被用作基础研究工具。越来越多的临床科学家对利用CRISPR-Cas9开发活细胞疗法的潜力感到兴奋。通过基因编辑，人们可以关闭、剔除或替换发生突变的、致病的基因，或提高免疫细胞的抗癌活性，等等。虽然CRISPR-Cas9的第一种治疗性应用最近已进入临床试验，但该技术仍然受到安全制造大量正确编辑的细胞这一挑战的限制。

传统上，科学家们依靠病毒载体---没有致病成分的病毒外壳，将用于基因治疗的DNA（称为DNA模板）携带到细胞中。然而，制造大量的临床级病毒载体一直是将细胞疗法带给患者的主要瓶颈。此外，人们不能轻易控制传统病毒载体在基因组内插入基因的位置。

Shy说，“使用病毒载体是成本昂贵和需要大量资源。非病毒基因工程方法的一个主要好处是，我们不像以前那样受到成本、制造复杂性和供应链挑战的限制。”

2015年，Marson团队与CRISPR先驱Jennifer Doudna博士的实验室合作，首次表明他们在利用电场使细胞的外膜更加通透的情形下，可以在没有病毒载体的情况下将短的DNA模板插入免疫细胞。2018年，他们开发了一种用CRISPR将较长的DNA序列递送到免疫细胞中的方法。

然后，在2019年，Marson团队发现，通过同时使用能够与Cas9酶---在CRISPR基因编辑过程中充当分子剪刀的蛋白---结合的改良版DNA模板，他们可以更有效地将新序列递送到基因组中的靶位点。

图为 CTS（Cas9 target sequence，Cas9靶序列）模板设计的比较

然而，还需开展更多的研究工作，以提高成功接受基因改造的免疫细胞的产量，并使该过程与未来的细胞疗法的制造兼容。这些目标促进了Marson团队开展这项新的研究。

DNA可以以单链或双链形式存在，而Cas9会附着在双链DNA上。这些作者很快发现，高水平的双链DNA模板对细胞有毒，因此该方法只能用于低量的模板DNA，这会导致编辑效率低下。

Marson团队知道单链DNA对细胞的毒性较小，即使在相对高的浓度下也是如此。因此，在这篇新的论文中，他们描述了一种将改良的Cas9酶附着在单链DNA模板上的方法，只需在两端添加一小段悬空的双链DNA。Marson说，“这给了我们一种平衡的、两全其美的方法。”

与传统的双链DNA模板相比，单链DNA模板可以使基因编辑的效率提高一倍以上。单链DNA分子的双链末端让人们可以使用Cas9来加强非病毒载体在细胞中的递送。

论文共同作者、加州大学旧金山分校实验室医学助理教授Jonathan Esensten博士说，“这项技术有可能使新的细胞疗法和基因疗法更快、更好、更便宜。”

通往临床的道路

在这项新的研究中，这些作者使用新的DNA模板产生了超过10亿个靶向多发性骨髓瘤的CAR-T细胞。CAR-T细胞是经过基因改造的T细胞，可以有效对抗特定的细胞或癌症。有了新的由Cas9指导的单链模板，大约一半的T细胞获得了新的基因，因而被转化为CAR-T细胞。

论文共同作者、加州大学旧金山分校血液学与肿瘤学科医学助理教授Justin Eyquem博士说，“我们知道，将DNA模板靶向基因组中称为TRAC（T-cell receptor α constant, T细胞受体α恒定区）位点的特定位点，将会提高CAR-T细胞的抗肿瘤效力。这种新的非病毒方法使我们能够更有效地实现这一目标，这将加快下一代CAR-T细胞疗法的开发。”

此外，这些作者发现他们的方法首次可以完全替换与罕见遗传性免疫疾病相关的两个基因，即IL2RA和CTLA4基因。

在过去，科学家们已发现他们可以替换IL2RA基因中特定患者发生突变的较小部分。如今，Marson团队证实他们可以一次性替换整个IL2RA和CTLA4基因---一种“一体适用”的方法，可以治疗这些基因发生不同突变的许多患者，而不必为每名患者的突变构建个性化的DNA模板。用这种基因工程方法处理的T细胞中，近90%获得了健康版本的基因。

Marson团队如今正在寻求批准，以推进在CAR-T细胞治疗和IL2RA缺乏症治疗中使用非病毒CRISPR技术的临床试验。

在一项新的研究中，来自美国康乃尔大学、荷兰代尔夫特理工大学和韩国浦项科技大学的研究人员为一系列CRISPR系统提供了新的见解，这可能导致在动物和植物中有前途的抗病毒工具和组织工程工具。他们着重关注新发现的CRISPR RNA引导的Caspase（CRISPR RNA-guided Caspase, Craspase）系统。相关研究结果于2022年8月25日在线发表在Science期刊上，论文标题为“Craspase is a CRISPR RNA-guided, RNA-activated protease”。论文通讯作者为康乃尔大学文理学院分子生物学与遗传学教授Ailong Ke博士和代尔夫特理工大学的Stan J.J. Brouns博士。

CRISPR-Cas系统是细菌中RNA引导的核酸酶，它在精确的位置切割病毒DNA或RNA靶标，以实现强大的基因组编辑应用。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）是一种蛋白酶家族，控制包括人类在内的动物体内的程序性细胞死亡。最近的一个发现是，类似于Caspase的蛋白可以与CRISPR-Cas关联在一起，这使科学界为之振奋。这种CRISPR引导的caspase被赋予了一个新的名字，即Craspase。

Ke说，“一方面，这种关联是完全出乎意料的，它指出了细菌中新的抗病毒作用模式。另一方面，我们可以利用这样一个系统来开发许多生物技术和治疗应用，如果我们了解这个分子机器内部的所有小组件。”

在这篇论文中，这些作者使用针对Craspase系统的低温电镜图来解释它们如何切割靶RNA并激活可以分解蛋白的蛋白酶。

Ke说，“这些低温电镜图导致了一部高清晰度的分子电影。通过来回观看，我们准确地知道Craspase是如何识别RNA靶标的，这又是如何激活蛋白酶的，这种活性持续多长时间，以及什么最终关闭了这种蛋白酶的活性。关于如何从这个平台汲取力量的想法开始涌入。”

论文共同第一作者、Ke实验室博士后研究员Chunyi Hu说，人们对Craspase系统有着巨大的兴趣。Hu说，“存在大量的竞争。我们和我们的荷兰合作者把我们的力量集中起来，日夜工作以解决这个难题。这个过程拥有令人兴奋的潜力，因为Craspase的输出是蛋白而不是DNA降解。”

Ke说，“对于其他CRISPR技术，人们担心我们用来编辑DNA的酶是否足够安全，是否可能有附带损害，即脱靶效应。有了Craspase，我们可以实现许多相同的有益治疗结果，而不必担心我们基因组的安全。”

Ke说，在这篇论文中报告的研究工作也有助于科学家们了解Craspase在细菌细胞内的作用。Ke说，“我们的合作者的研究工作已表明，它就像一个主开关---蛋白水解切割在细菌细胞中引发了一连串的事件，很可能最终杀死了它们。我们在这项新的研究中得到了部分答案。我们仍在调查。”

这项新研究还将帮助科学家们了解人类细胞途径中的程序性细胞死亡与细菌细胞途径中的相同过程之间的相似性。Ke说，“我们意识到相同的一组蛋白酶（caspase）正在控制两个生命王国中的程序性细胞死亡途径，这项观察揭示了这一途径是多么根深蒂固。”

除了深入探究这一过程的功能方面，Ke说，而且他们将进入应用方面，这可能包括动物组织工程和农业工程。Ke说，“我希望更多的科学家们能够探究这个系统的潜力并加入进来。我们都认为CRISPR引导的核酸酶是一种治愈遗传疾病的工具，但是CRISPR引导的蛋白酶可能以更广泛的方式对生物学产生影响。”

CRISPR/Cas9，俗称“基因剪刀”，是一种精确的基因编辑技术。它允许将所需的DNA序列引入到基因组的（几乎）任何位置，从而修改或灭活一个基因。这种技术被广泛用于生物医学研究，而且一些基于CRISPR/Cas9的疗法正在进行临床试验，用于治疗人类血液疾病、某些类型的癌症和HIV感染以及其他疾病。

在一项新的研究中，西班牙巴塞罗那生物医药研究所研究员Fran Supek博士及其研究团队报告说，根据人类基因组的靶序列位点，CRISPR/Cas9基因编辑可以引起细胞毒性和基因组不稳定性。这种不想要的影响是由关键的肿瘤抑制蛋白p53介导的，并由编辑位点附近的DNA序列和周围区域的多种表观遗传因子决定。相关研究结果于2022年8月4日发表在Nature Communications期刊上，论文标题为“TP53-dependent toxicity of CRISPR/Cas9 cuts is differential across genomic loci and can confound genetic screening”。

利用计算方法，这些作者分析了为人类细胞设计的最受欢迎的CRISPR文库，并检测到了3300个显示出强烈毒副作用的靶序列位点。他们还报告说，大约15%的人类基因含有至少一个显示出毒副作用的编辑位点。

Supek博士解释说，“我们的研究解决了与TP53相关的Cas9毒副作用的一个重要问题---也是最近有一些争议的问题，它也提供了如何回避这个问题的指南。避免在这些‘风险’位点上进行编辑，不仅会使CRISPR编辑更有效，更重要的是更安全。”

一个特定的基因可以在不同的位点被编辑。论文第一作者、巴塞罗那生物医药研究所的Miguel-Martin Álvarez博士说，“基因中对调节很重要或有某些表观遗传标记的区域是最有可能触发p53反应的区域，因此，作为一般建议应避免使用。”

p53介导的毒性和肿瘤发生

p53是一种被称为基因组守护者的蛋白。它检测DNA损伤并引导细胞停止分裂，并可导致程序性死亡，从而防止它们增殖和扩大其DNA中的“错误”。因此，p53是一种预防癌症和其他DNA损伤相关并发症的天然保护机制。

CRISPR基因编辑通常需要切割两条DNA链。在某些情况下，这种操作会引发p53反应，在这种反应下，受到基因编辑的细胞会被“标记”为受损，然后被清除，从而降低基因编辑过程的效率。

然而，关于p53和基因编辑的主要复杂情况是，克服CRISPR编辑的细胞可能正是因为p53功能缺陷而做到这一点。也就是说，这些细胞可能不太能够检测到DNA损伤和/或对细胞进行标记随后遭受程序性死亡。因此，这种基因编辑方法最终可能有利于具有不稳定基因组的细胞群体，这意味着它们容易积累进一步的突变，从而增加出现恶性肿瘤的风险。

Supek博士总结道，“这种不想要的后果可能会招致基因组不稳定的风险，这在体外CRISPR疗法中是非常不可取的，在这种疗法中，患者的细胞在实验室中接受基因编辑，并重新引入患者体内。我们希望我们的研究为如何设计更安全的CRISPR试剂提供一些指导，并鼓励对这一问题进行进一步研究。”

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