来自中科院生物物理所的陈润生、张树利、骆健俊科研团队在杂志 Cell Reports (IF=9.423) 上发表文章《Identification and characterization of long non-coding RNA Carip in modulating spatial learning and memory》。

长期以来 CaMKII 被认为是突触可塑性的关键的效应器。最近的研究表明，多种调节剂可与 CaMKII 的亚基相互作用以调节海马神经元的长时程增强效应(LTP)。然而，长链非编码 RNA 是否会调节 CaMKII 的活性并影响突触的可塑性目前仍不清楚。在该研究中，研究人员鉴定出了一种以前未被表征过的长链非编码 RNA， Carip， 它可以作为一种支架来发挥作用，与 CaMKIIβ 特异性来进行相互作用，并调节海马中 AMPA 和 NMDA 受体亚基的磷酸化。同时 Carip 的缺失会导致突触传递功能的障碍并减弱海马 CA3-CA1 突触中的 LTP 作用，从而导致空间学习和记忆的障碍。总而言之，研究人员的研究结果表明 Carip 通过改变 AMPA 受体和 NMDA 受体的活性来调节长时程突触的可塑性，从而影响小鼠的空间学习和记忆能力。

北京唯尚立德有幸为该研究提供了 C57/BL WT mice， C57/BL Carip KO mice， C57/BL Carip Rescue mice 小鼠，为能够对科研人员对脑科学的研究提供一定的助力唯尚深感荣幸。

为了系统的探索 lncRNA 是否与 CaMKIIβ 的功能相关，研究人员首先通过 RNA 免疫沉淀测序 (RIP-seq)， RIP-qPCR， WB， qPCR， FISH 等方法鉴定出了一种与 CaMKIIβ 的功能相关的 lncRNA 并将其称之为 Carip， 并通过分析显示该 lncRNA 具有与蛋白质相互作用的能力，从而推断 Carip 可能与海马神经元中的 CaMKIIβ 有相互作用。之后通过 pull-down， EMSA 等实验证明 Carip 和 CaMKIIβ 之间存在有特异性地结合。

为了评估 Carip 的功能及其与 CaMKIIβ 的交互作用，通过 CRISPR 方法构建了 Carip KO C57BL/6 小鼠，通过对 WT and Carip KO 小鼠的海马组织来进行 RNA-seq 分析，结果显示 Carip 对钙离子具有潜在的调节作用。为了排除 CRISPR 的非特异性作用，又在 Carip KO 小鼠中敲入 Carip 来构建了 Carip Rescue C57BL/6 小鼠，通过对 WT， Carip KO and Carip Rescue 小鼠来进行 WB， HE 等实验，结果显示 Carip 的敲除并不会影响 CaMKIIβ 的表达，也不会损害海马神经元的发育，然而对 Carip 的敲除和恢复会影响 CaMKIIβ 下游的 AMPAR and NMDAR 的磷酸化水平。

通过在 WT and Carip KO 小鼠来进行 IP 等实验，结果显示在敲除 Carip 后会削弱 CaMKIIβ 与 GluA1 and GluA2 的结合，从而推测 Carip 可能是稳定 CaMKIIβ 和 AMPAR 的支架，从而来调节海马神经元中的 AMPAR 的活性。

接下来，研究人员研究了 Carip KO 是否会对海马神经元间的突触传递和 LTP 产生影响，通过使用电生理学等方法，结果显示在 Carip KO 的小鼠和细胞中微型兴奋性突触后电流 (mEPSC) 的频率不受影响，但幅度会略有下降，在 Carip Rescue 小鼠和细胞中 mEPSC 的频率与 WT and Carip KO 小鼠相似，但幅度会略有恢复。因此推断 Carip 可能参与了对突触后神经传递的调节。通过对 AMPAR-EPSCs 配对脉冲比(PPR 表示突触前的电强度)的测量，发现在 WT， Carip KO and Carip Rescue 小鼠中 PPR 没有显著差异，从而表明 Carip 调节的是海马神经元中的突触后的传递而非突触前的传递。

由于 Carip KO 小鼠中的 NMDAR 的磷酸化水平降低，因此研究人员进一步的评估了 NMDAR 介导的 EPScs(NMDAR-EPSCs)，结果显示，与 NMDAR 磷酸化的减少一致，在 Carip KO 小鼠中 NMDAR-EPSCs 的振幅也被抑制。同样的，与 WT 小鼠相比，在 Carip KO 小鼠中 NMDAR 与 AMPAR 所介导的 EPSC 的比率(NMDAR/AMPAR-EPSC)也发生了显著地降低，而在 Carip Rescue 小鼠中却得到了逆转。而突触后的 AMPAR 和 NMDAR 的变化通常会伴随着 LTP 的变化，因此，研究人员研究了海马 CA3-CA1 通路中由刺激所诱导的 LTP 作用，结果显示 Carip KO 小鼠中的 LTP 虽然被诱导但却显著的被减弱了，而在 Carip Rescue 小鼠中却得到了逆转。因此，这些结果表明 Carip 会影响海马中 AMPAR 和/或 NMDAR 所介导的突触后反应和 LTP 作用。

由于 LTP 是海马突触可塑性的一种典型的形式，被认为与学习和记忆相关。因此，研究人员对 Carip KO 小鼠中 LTP 的衰减是否会导致空间学习和记忆的障碍来进行了研究。通过使用 Morris 水迷宫等行为学实验，研究发现在训练期间，与 WT 小鼠相比 Carip KO 小鼠寻找平台的时间就发生了增加，而 Carip Rescue 小鼠的表现与 WT 小鼠相似。在 24 小时以后，研究人员移去平台以测试不同小鼠间的空间记忆能力，与 WT and Carip Rescue 小鼠相比 Carip KO 在之前平台的位置处表现出随机的行为。而 Carip Rescue 小鼠与 WT 小鼠的表现相似。因此，数据表明 Carip 在小鼠的空间学习和记忆中起着非常重要的作用。

本研究所用 C57/BL WT mice， C57/BL Carip KO mice， C57/BL Carip Rescue mice 小鼠均由北京唯尚立德生物科技有限公司提供。本公司成立于 2011 年 3 月，是由来自北京大学、中国医学科学院的科研团队产业转化而来的国家高新技术企业，也是国内第一家提供基因编辑技术服务的公司，拥有丰富、成熟的基因编辑动物构建经验。此外，本公司也可提供动物繁育、动物实验和数据分析等一站式服务。为广大科研工作者的科学研究工作保驾护航。

欢迎有做基因编辑小鼠和动物繁育需求的新老客户前来咨询了解！

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.celrep.2022.110398

返回列表