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2021-04-02

大连医科大学附属第一医院的乐卫东教授的课题组在 Cell Death & Disease 发表了研究论文 Essential role for autophagy protein VMP1 in maintaining neuronal homeostasis and preventing axonal degeneration(https://doi.org/10.1038/s41419-021-03412-5)。

研究了在小鼠中敲除 VMP1 基因后对中脑中的多巴胺能神经元的影响。定位于内质网的 VMP1 蛋白对哺乳动物细胞中的自噬过程有着非常关键的作用,研究人员通过使用,经他莫昔芬诱导的CreERT2/loxP 基因靶向系统发挥作用的 VMP1fl/fl/DATCreERT2小鼠有选择地在中脑中的多巴胺能神经元中敲除了 VMP1 基因。该 VMP1fl/fl/DATCreERT2条件性敲除的小鼠表现出了进行性的运动功能障碍,伴随着黑质致密部中的多巴胺能神经元的大量丧失和扩大的末端中的突触前α-syn 蛋白的积累。机理研究表明,多巴胺能神经元中的 VMP1 基因的缺乏会导致 LC3 蛋白的增加,和黑质致密部神经元中的螯合体 1/p62 的积累,提示了在这些神经元中的自噬通量受到了损伤。此外,VMP1 缺乏会导致多种细胞的异常,包括大型的空泡状的结构(LVS),线粒体受损,内质网肿胀以及泛素+聚集体的积累,揭示了 VMP1 在调节神经元存活和维持轴突稳态中的未知作用,表明了 VMP1 的缺乏可能会通过自噬途径来促进中脑中的多巴胺能神经元类的神经退行性疾病的产生。
VMP1 一种定位于内质网的蛋白,由于其在介导自噬过程中的重要作用,最近引起了人们的关注。VMP1 基因编码包含六个疏水区域的跨膜蛋白,该蛋白含有 406 个氨基酸。其中,与自噬相关(ATG)的结构域位于链的中间。一旦在 ATG 结构域发生突变,VMP1 就无法诱导 LC3 蛋白的募集并失去与 Beclin-1 的作用,最终阻止自噬的引发。但是,最近的工作表明,在 VMP1 敲除的哺乳动物细胞的内质网膜中,当营养条件异常时,VMP1 的缺失反而会促进可被 LC3 标记的自噬结构的累积,这表明 VMP1 可能是通过调节内质网膜与自噬隔离膜之间的相互作用,从而在自噬过程中发挥着重要的作用。这些研究表明,VMP1 的缺乏会抑制自噬体的成熟,破坏其与内质网膜的结合,并阻止它与溶酶体的融合。除了在动物实验中,在双歧杆菌、植物和衣藻中的研究还表明 VMP1 高度参与蛋白质的分泌、吞噬作用、渗透调节和胞质分裂等过程,以介导不同的细胞过程。
自噬-溶酶体途径负责清除细胞内的蛋白质聚集体,其功能障碍与几种神经退行性疾病有关,例如,帕金森综合症(PD),阿尔茨海默症,肌萎缩性侧索硬化症和亨廷顿氏病。到目前为止,已经构建了多种专门在神经系统中敲除了自噬相关基因的小鼠模型,如 Atg5fl/fl/Nestincre,Atg7fl/fl/Pcp2Cre,FIP200fl/fl/Nestincre,ULK1/2fl/fl/Nestincre从而可以分析自噬在神经退行性病变中的作用。但是,作为关键的自噬成分,尚未在体内研究过 VMP1 基因在中枢多巴胺能神经元中的作用。在此次的研究中,研究人员建立了VMP1fl/fl/DATCreERT2小鼠模型(也称为 VMP1cKO),该模型可在他莫昔芬(TAM)的处理下,在表达多巴胺转运蛋白(DAT)的细胞中特异性地敲除自噬相关的基因 VMP1。研究人员证明了VMP1 cKO 小鼠可发展出严重的运动功能障碍,并伴有大量的中脑多巴胺能神经元和纹状体轴突末端的丧失。此外,在 VMP1 CKO 小鼠的纹状体中发现有包含 α-syn+ 内含物的扩大的mDAergic 轴突末端。此外,缺失VMP1mDA神经元还显示出线粒体受损,内质网膜肿胀,较大的液泡状的结构(LVS)和泛素+聚合体地积聚。综上所述,研究人员的研究为VMP1的缺失对自噬介导的 mDAergic 神经元变性的致病性的作用提供了有力的证据。
VMP1 基因是自噬相关途径的核心部件之一。为了确定其在哺乳动物 mDA 神经元中的作用,研究人员首先建立了在 mDA 神经元中特异性敲除 VMP1 基因的小鼠模型。在 周龄时,向 VMP1cWT  VMP1cKO 小鼠的腹膜内同时注射 TAM(1A)。研究人员记录了这些小鼠的体重和身体状况,发现 VMP1cKO 小鼠在注射后的第 4 周显示出明显的身体损失。之后在第 70 天大小时处死小鼠,首先使用免疫荧光(IFC)染色检测 SNc 中的 VMP1 蛋白的表达。正如预期的那样,VMP1cKO 小鼠 SNc 中的 mDA 神经元的 VMP1的表达水平显着降低(1BC),表明 VMP1 被成功敲除。此外,对 VMP1cKO  VMP1cWT 小鼠中的脑和纹状体的匀浆样本进行了 WB 的生化分析,也证实了 mDAergic 神经元中的 VMP1 蛋白被成功的删除了(1DE)。为了评估 VMP1 的敲除对运动方面的影响,分别在小鼠的第 49 天和第 63 天对它们进行了旷场实验。实验发现,与相同周龄的 VMP1cWT 小鼠相比,VMP1cKO 小鼠在出生后的第 63 天的总行进距离,垂直运动(垂直时间和计数)和刻板运动(刻板时间和刻板计数)都显著的降低(2A-E),表明 VMP1cKO 小鼠表现出进行性的运动缺陷。此外,在出生后的第 63 天的小鼠的实验视频记录显示,VMP1cKO 小鼠表现出不平衡的,颤抖式的行走方式,而这些在 VMP1cWT 小鼠中却没有观察到。此外,旋转杠实验表明 VMP1cKO 小鼠在旋转杆上停留的时间更少(2F),表明 VMP1cKO 小鼠表现出,运动协调受损的渐进性进展的模式。另外,研究人员在出生后第 60 天也对小鼠进行了 迷宫测试和尾巴悬吊测试,没有发现显着的差异,表明在 VMP1cKO 小鼠中没有发展出认知性的障碍(2G)。此外,在尾部悬吊的测试中,VMP1cKO  VMP1cWT 小鼠的固定时间相当(2H)
在 mDAergic 神经元中条件性的敲除 VMP1 基因
在 VMP1cKO 小鼠的运动障碍
为了分析敲除小鼠的运动缺陷与 mDA 神经元丧失之间的相关性,研究人员又对 TH(多巴胺能神经元的分子标记)进行了免疫荧光(IFC)染色以量化 mDA 神经元。与同周龄的 VMP1cWT 小鼠相比,10 周龄 VMP1cKO 小鼠 SNc 和 VTA 中的 mDA 神经元的数量分别显著地减少了 59% 和 20(3AC)。此外,随着大量肿大的出现,mDA 神经元轴突末端的纤维密度也发生了急剧的下降(3DF),这表明在 mDA 神经元中 VMP1 的缺乏会导致躯体和轴突的神经元的损伤。多巴胺(DA),由多巴胺能神经元合成的独特的儿茶酚胺类的神经递质,可通过 HPLC 测定它的含量(3G-I );同时也使用 WB 检测了 DA 合成的关键酶 THDA 的平均浓度从 VMP1cWT 小鼠中脑中的 151.6 pg/uL 显著地降低到了 VMP1cKO 小鼠中的 36.85 pg/uL(3H),并且从 VMP1cWT 小鼠纹状体中的 1287 pg/uL 降低到了 VMP1cKO 小鼠纹状体中的 340 pg/uL(3I)。相应地,VMP1cKO 小鼠与 VMP1cWT 相比,TH 蛋白的水平在脑和纹状体中分别下降了 52% 和 58%。实验数据揭示出,在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经系统中表现出了严重的功能障碍。
对 VMP1cKO 小鼠 SNc—纹状体通路的神经病理学检查和 DA 的测定
由于 VMP1cKO 小鼠表现出大量的 mDAergic 神经元损失,研究人员进一步阐明了细胞死亡的机制。程序性的坏死是细胞坏死的一种高度受调控的形式,并且被认为是一种会高度促进炎症反应的细胞死亡的模式。当程序性的坏死被诱导时,RIPK3 蛋白会被磷酸化而活化,被激活的 RIP3 又可以在第 349 位苏氨酸,第 345 和 347 位丝氨酸残基上,磷酸化一系列的激酶,如 MLKL 激酶。基于这些以有的研究,研究人员由此检测了 VMP1 基因的缺失所引起的 mDAergic 神经元的丧失,是否与细胞的坏死有关。通过使用抗磷酸化 RIPK3(Thr231/Ser232), MLKL(S345) 的抗体,研究人员进行了 IFC 染色,发现在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中,活化的 p-RIPK3 发生了显著的浓缩,并在细胞质中形成了离散状的散点(4A, B)。相应地,被活化的 p-MLKL 也发生了显著的积累,并在 mDA 神经元的细胞核和细胞质中也形成了大的散点(4C, D),这些结果表明,由于 VMP1 的缺乏,在 mDA 神经元中诱导了程序性的坏死。接下来,研究人员又检查了在中脑区域的 caspase-3 的激活情况,结果显示,在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中显示有被活化的 caspase3(Asp175) 的点状的聚合,而在 VMP1cWT 小鼠中却几乎未观察到 caspase-3 的激活(4E, F)。这些结果表明,除了坏死外,细胞的凋亡也可能与VMP1 缺乏所引起的神经元的死亡有关。
对 VMP1cKO 小鼠 mDAergic 神经元坏死的检测
在正常情况下,一定水平的自噬的进行对于维持细胞的稳态是至关重要的。因此,研究人员也研究了 VMP1 基因的敲除是否会破坏 mDAergic 神经元中正常进行的自噬水平。在 VMP1cKO 小鼠 mDA 神经元的躯体中发现积聚了大量的点状的 p62(5A, B)。类似地,大的斑点状的 LC3+ 也被发现集中在 VMP1cKO 小鼠 mDAergic 神经元的躯体中,而在 VMP1cWT 小鼠中,却并没有观察到这种现象(5C, D),这表明在 mDAergic 神经元中 VMP1 的敲除导致了 LC3 标记的自噬小体的累积。双重染色的结果显示,在空腹的 VMP1cWT 小鼠的 mDA 神经元中,LC3 标记的聚合点,通常与 LAMP1 标记的溶酶体共定位在一起(5EH)。但是,这样的共定位在同周龄的空腹的 VMP1cKO 小鼠中却被破坏了(5EH),这表明大多数的 LC3 信号未能与 LAMP1 信号发生融合。免疫印迹的结果还证实,与 VMP1cWT 小鼠相比,VMP1cKO 小鼠的脑中的 p62 和 LC3 的水平均升高(5IK)。在将 VMP1cKO 小鼠和 VMP1cWT 小鼠的中脑来进行比较时,LAMP1 和 Beclin1 蛋白的表达水平均未显著的改变(5L, M)。此外,根据先前的报道,透射电镜(TEM)分析的结构显示VMP1cKO 小鼠 mDA 神经元中的自噬体的数量明显得增加(5N, O),这表明在 VMP1 敲除的 mDA 神经元中,自噬的水平在融合的阶段受到了损害。另外,尽管自噬体与溶酶体的融合,在 VMP1 敲除时被阻止(5EH),但 VMP1 的敲除所引起的溶酶体的形态学的改变并没有被发现(5P, Q)。降解性的自噬泡(AVd)(包括溶酶体和两性体)通常具有单层的膜结构,并且在降解的各个阶段,通常含有电子致密性的细胞质物质和/或细胞器。研究人员在来自 VMP1cWT 小鼠的 mDA 神经元中发现了大量的 AVd(5R)。然而,在 VMP1cKO 小鼠中,却几乎未发现 AVd,但看到了丰富的不规则形态的直径增大(> 500 nm)且腔内物质含量清晰(5S)的液泡状的结构(LVS),这些都表明自噬过程的降解步骤被破坏。
5 VMP1cKO 小鼠 mDA 神经元中的自噬被破坏
接下来,研究人员确定了 VMP1 敲除对 mDAergic 神经元细胞器的影响。同样使用了 TEM 的分析方法,以评估线粒体的形态。在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中发现了许多球形的线粒体,而在 VMP1cWT 小鼠中未发现(6A)。此外,相比于 VMP1cWT 小鼠,在 VMP1cKO 小鼠的 mDAergic 神经元中的线粒体的平均周长显著的增加,显示有肿胀的迹象(6B)。此外,在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中,超过 90% 的线粒体嵴都减少、破坏甚至消失了,这表明在 mDAergic 神经元中 VMP1 的敲除造成了线粒体的损坏(6C)
6 VMP1cKO 小鼠 mDA 神经元中的线粒体被破坏
接下来,研究人员分析了粗糙内质网(RER)结构,发现与 VMP1cWT 小鼠相比,VMP1cKO 小鼠的 RER 形态发生了显著的变化(7A)。与 VMP1cWT 小鼠相比(40.8 nm)VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中 RER 小管的平均宽度增加了一倍(83.6 nm)(7B),并且 RER 小管的比例(>100nm) VMP1cWT 小鼠 mDAergic 神经元中的 0.05 增加到了 VMP1cKO 小鼠中的 16.65(7C)。这些结果都表明,由于 VMP1 的敲除mDA 神经元中的 RER 遭受到了严重的损伤。已知 SEC31A 参与了 ER  ER 高尔基体运输过程中的囊泡的萌发。研究人员发现,SEC31A  VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元中积聚,形成了比较大的散点(7DE)。相应地, VMP1cKO 小鼠中,SEC16A( ER 到高尔基体的转运因子), SEC31A  SEC31B  mRNA 水平都发生了显著的上调。这些结果表明,在 VMP1 敲除时,ER  ER 到高尔基体的转运的囊泡生发都是异常的。
7 VMP1cKO 小鼠 mDA 神经元中的粗糙内质网结构的改变
为了进一步阐明 VMP1  mDAergic 神经元病变中的潜在作用,研究人员通过 IFC 染色检查了内源性 α-syn 蛋白的聚集。实验发现,α-syn 分散的存在于 VMP1cWT 小鼠的 mDA 神经元的体干中(8A),这与其他的报道表明的内源性 α-syn 出现在 C57BL/6J 小鼠的 SNc  VTA 中是一致的。但是,在同周龄的 VMP1cKO 小鼠中,神经元体干中的内源性 α-syn 蛋白的水平急剧地降低,并且其中没有发现有明显的内含物(8AB)。出乎意料的是,研究人员发现 VMP1cKO 小鼠纹状体中的扩大的轴突末端高度聚集了 α-syn 夹杂物(8CD),揭示了 mDA 神经元中,VMP1  α-syn 转运到轴突的末端有较大的影响。由此为 VMP1 在调节 α-syn 轴突运输中的作用提供了证据。
8 VMP1cKO 小鼠纹状体轴突末端中 α-syn 包裹体的聚集
接下来,研究人员使用抗泛素(一种错误折叠的蛋白质的经典标记)的抗体检查了中脑和纹状体中的蛋白质的聚集。结果发现在 VMP1cKO 小鼠的 mDA 神经元的细胞质中积累了大量的泛素+的点,而在 VMP1cWT 小鼠中未观察到这种聚集的现象(图8E, F)。同样,在纹状体中也发现了大量的泛素+的点,但在扩大的轴突末端中却没有发现这种现象(图8G, H)。这些发现表明,由于 VMP1 的敲除引起了中脑和纹状体中的错误折叠的蛋白质的积累。
综上所述,研究人员证明了在 mDA 神经元中敲除 VMP1 基因会导致运动障碍,严重的 mDA 神经元丢失,线粒体异常和自噬进程的破坏等。令人惊讶的是,在 VMP1cKO 小鼠扩大的纹状体的轴突的末端广泛地发现了 α-syn 内含物的积累,这表明 VMP1 在自噬介导的微管运输和 ER-高尔基体的运输过程中,起着至关重要的作用。据推测,VMP1 基因在黑质纹状体通路中的缺失,可能会引起在轴突末端的蛋白质的折叠错误,并最终触发 mDAergic 神经元的变性。揭示了 VMP1 在调节神经元存活和维持轴突稳态中的新作用,这表明 VMP1cKO 小鼠可以作为阐明自噬损伤所致的 mDA 神经变性机制研究的非常有用的临床前模型。
本研究中所使用的 VMP1 floxp 敲入小鼠由北京唯尚立德提供,该小鼠在 C57BL/6 的背景下通过 CRISPR/Cas 9 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验,已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型,同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台,欢迎您致电咨询。