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2021-03-03

众所周知,自古以来人类就备受疾病的折磨,极大的影响了人们的身心健康和生活水平,而疾病的发展过程通常都十分的复杂,若以人本身作为实验的对象来对疾病的发生机制来进行探讨,这样不仅会使得医学的进展难以进行快速的推动,并且通过临床经验的积累来研究疾病,不仅在时间和空间上存在有极大的局限性,而且很多实验在人体上进行会受到诸多的方法和道义上的谴责。而若有合适的动物模型来模拟对应的人类疾病,借助于对动物模型的间接研究,不仅可以获得大量的研究材料,而且可以对疾病的发生过程能进入更深层次的分析,可以更有效率的认识疾病的发展规律和研究相应的防治措施及药物。

近年来,随着基因工程技术的发展,基因编辑大鼠作为包括癌症在内的人类疾病研究的最佳模型的探讨日益受到重视,因为大鼠在生理上比小鼠更接近人类。然而,由于高成本和技术要求,基因工程鼠的构建受到了严重的阻碍。幸运的是,目前已经出现了一些有效的、有针对性的基因编辑技术,包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALENs)和最新发展起来的规则间隔短回文重复序列技术(CRISPR),这些都有助于有效地修饰基因组 DNA 序列。TALENs 是可定制的 DNA 结合核酸酶,可以靶定几乎任何序列的基因组。每个TALEN 由两个结构域组成,一个结构域由重复单元构成,形成 DNA 的结合域,另一个结构域为 FokI 核酸内切酶,具有内切酶的非特异性剪切活性。每个重复单位由 33-35 个氨基酸组成,相邻的 12和 13个氨基酸可以特异性的识别 DNA 的核苷酸序列,如 NI 的氨基酸、NN 的氨基酸、 NG 的氨基酸、HD 的氨基酸分别可以识别 a、g、 t、 c 碱基。因此,TALEN 基因组编辑工具具有较高的准确性和特异性,可以在普通的分子生物学的实验室中,进行设计、克隆、组装和测试。

郑州大学第一附属医院肿瘤科的研究人员利用 TALEN 技术成功地构建出了一个 FH 基因敲除的大鼠模型(Generation of TALEN-mediated FH knockout rat model), 在该研究所构建的大鼠模型中,经验证,FH 基因的第一个外显子中成功的被删除了 11 个碱基对。同时在注射的 80个受精卵中最终获得了 18 个阳性的突变后代,有效率为 22.5%,由此也表明 TALEN 技术的基因敲除的成功率相对还是比较高的。并且在获得的子代中,发现只有杂合子。十六对 FH+/-敲除杂合子大鼠被安排进行了为期 6 个月的杂交实验,仍没有鉴定出任何纯合子 KO 大鼠。同时,研究人员对妊娠大鼠的胚胎标本也进行了测序鉴定,也未发现有 FH KO 的纯合子大鼠,说明 FH 基因被完全敲除后是会胚胎致死的。相比之下,雌雄 FH+/-KO大鼠可以正常繁育,但繁殖能力均有所下降。除 FH+/-KO 雄性大鼠在 16 周左右时的体重显著增加外,FH+/- KO 组与对照组大鼠在表型上并无明显的差异。血液学检测和生化检查显示 FH+/- KO 大鼠存在造血和肾功能障碍,FH+/- 敲除杂合子大鼠的肾小球周围显示有小管上皮细胞的小间变性病变,并且在这些细胞中 Ki67, p53, Sox9 等基因的表达也相对提高,这些结果可能与大鼠的生化检查所反映的肾功能障碍有关。由此,研究者们成功地建立了 FH+/-KO 大鼠模型,为进一步的研究 FH 基因的功能奠定了基础。


在该研究中,研究人员利用 TALENs 的位点特异性的基因修饰功能,建立了一个新的 FH 基因敲除(KO)大鼠模型。FH 在三羧酸循环中起着非常重要的作用,它催化延胡索酸水合生成 L-苹果酸盐。FH 基因的杂合突变可导致非典型的子宫平滑肌瘤、遗传性平滑肌瘤病和肾细胞癌。此外,研究表明 FH 的缺失可能导致代谢紊乱、严重的脑病、癫痫发作和神经功能不良等代谢疾病。
细胞和组织中 FH 基因的功能失调造成了大量的延胡索酸的积累,延胡索酸盐被认为可以促进癌症的发展,这表明 FH 是一种肿瘤抑制因子。因此,研究人员在本研究中主要探讨了,可稳定遗传的 FH 基因敲除大鼠的模型,是否能成功的被建立,并且研究了在大鼠中敲除 FH 基因后所产生的主要影响。
研究人员利用 Golden gate 法构建了靶向 FH 基因的 TALEN 质粒,见下图 1A 和图 1B。所有靶向 FH 基因的 TALENs 质粒,其中的 TAL 重复序列可以特异性地结合 FH 基因的 DNA 序列,而 FokI 内切酶则可以精确地对 FH 基因的序列进行剪切。表 1 显示了四对靶向 FH 基因外显子 1 的 TALEN 质粒。经实验验证,结果显示 FH-T3 具有最高的剪切活性(图 1c)。
图 1
将 TALEN mRNA 注射到 SD 大鼠的受精卵的细胞质中,然后将胚胎移植到假孕大鼠的子宫中。移植的 80 个受精卵共出生了 18 个带有突变的后代。之后对阳性小鼠进行了测序,以确定对 FH 基因的外显子 1 进行了哪些碱基的敲除,如图 2b 所示。野生型大鼠的序列经比对与大鼠基因组数据库中的序列完全相同(图 2a)。与野生型大鼠的基因序列相比,杂合子的首建大鼠在 FH 基因的第一个外显子中删除了 11 个碱基,缺失的碱基数不是 3 的倍数,如图 2C1 所示,用红色标记,序列缺失后,在 FH 基因的 exon 1 中引入了一个提前终止翻译的终止密码子 taa,如图 2C2 所示,标记为紫色。 
图 2
为了探讨 FH+/- 基因敲除杂合子大鼠是否会影响产仔数,研究人员进行了下述的交配实验:先用雌性的首建鼠大鼠与野生型的雄性 SD 大鼠进行交配,保留子代出生的杂合子大鼠,之后再用雌性和雄性的杂合子大鼠进行相互交配。有趣的是,与野生型大鼠相互交配所显示出的繁殖能力相比,杂合子的 KO 大鼠与 WT 大鼠交配时的产仔数下降了 27.4%,而杂合子 KO 大鼠与杂合子大鼠交配时的产仔数则下降了 40.0%,如图 3a 所示。杂合与杂合交配组所出生的 FH KO (FH+/-)的杂合子大鼠,比杂合与野生交配组所出生的杂合子数要多,杂合与杂合交配组的杂合子占产仔数的 58.0% 左右,而杂合与野生交配组的占比率为 29.6%。然而,在六个月的繁殖实验中,16 对杂合子配杂合子的交配对所出生的子代中,并没有鉴定出一只纯合子。为了进一步阐明纯合子 FH KO 大鼠的胚胎致死性,研究人员从妊娠大鼠中分离出了 E8.0(图 3B)至 E15.0(图 3C)的大鼠胚胎,之后研究人员对这些胚胎的基因组进行了 PCR 反应及测序分析,结果如图 3D1(WT)和图 3D2(FH+/-)所示。同样的,在这些胚胎中也没有发现纯合子的 FH KO 大鼠,表明在 FH-/- KO 大鼠中完全敲除 FH 基因后,会造成胚胎致死。
图 3
为了进一步分析 FH 基因在 FH+/- 杂合子大鼠中的表达情况,研究人员分别采用 qPCR 和 WB 的方法检测了 FH 基因的转录水平和蛋白的表达情况。与野生型大鼠相比,FH 基因在心、肝、肺、肾、脑、脾、胃、睾丸等组织中的表达均有不同程度的下降,在肾脏中下降率达 67.2% (p < 0.001)。同样,FH+/- KO 大鼠的心、肝、肺、肾、脑、脾、胃和睾丸等组织中的 FH 蛋白的表达也有不同程度的减少,如图 4B 所示,定量结果如图 4C 所示,肾脏中的敲除率高达 16.3% (p < 0.001)。研究人员还使用免疫荧光显微镜对 FH+/- KO 大鼠和野生型对照大鼠的成纤维细胞中的 FH 基因的表达进行了观察,如图 4D 所示。在对照组大鼠的成纤维细胞中可检测到细胞质中的 FH 蛋白的表达,而 FH+/- KO 大鼠的成纤维细胞中的免疫染色就减少了很多。
图 4
除体重外,WT 组和 FH+/- KO 组大鼠的行为无明显差异,如图 5A 所示。FH+/- 雄性杂合子大鼠在 16 周的观察期内体重显著增加(图 5B),而雌性 FH+/- 杂合子大鼠(图 5C)在同一观察期内体重却没有显著差异。FH+/- 雄性杂合子大鼠在 12 周左右时,体重表现出最大的差异,高达 81.0% 左右(p = 0.012)。
图 5
为了探讨 FH+/- 杂合子大鼠中,FH 基因的敲除是否会影响到血液生化指标的变化,研究人员对一系列相关的血液标本进行了检测。测量结果见表 4。如图 6A1 所示,与野生型大鼠相比,FH+/- KO 大鼠中的白细胞(WBC)、血小板压积(PCT)、单核细胞增多(%MONO)、淋巴细胞(#LYMPH)和嗜酸性粒细胞百分比(#EOS)分别降低了 49.0% (p = 0.004), 14.7% (p = 0.039), 24.5% (p = 0.025), 51.6% (p = 0.007) 和 58.0% (p = 0.023),并且雄性大鼠(图 6A2)和雌性大鼠(图 6A3)的变化趋势一致。与对照组大鼠的淋巴细胞相比(图 6B1),FH+/- KO 大鼠的淋巴细胞在形态学上显得并不成熟(图 6B2)。另外,与对照组相比,FH+/- KO 组大鼠中的血清尿素氮(BUN)和肌酐(CRE)分别增加了20.1% (p = 0.012) 和 12.7% (p = 0.010)。另外,FH+/- KO 大鼠中的血尿酸降低,降低约 25.0% (p = 0.024),这种差异在雄性(图 6C2)和雌性(图 6C3)大鼠中一致,提示 FH+/- KO 大鼠存在造血和肾功能障碍。 
图 6
根据 FH+/- KO 大鼠肾功能的异常结果,研究人员进一步对大鼠的肾脏进行了组织学和组织免疫学的评价(图 7)。组织学上,FH+/- KO 大鼠肾髓质部分的小病灶显示出间变性的改变,且肾小球周围的小管上皮细胞中显示出突出的多形性大核及略粗的染色质。这些间变性的较大的上皮细胞为 Ki67 阳性,而对照组大鼠的同一区域的肾小管上皮细胞却大部分为阴性或弱阳性。P53 基因的免疫染色的结果也同样如此。在对照组大鼠的肾小管上皮细胞中,p53 的免疫反应结果大部分为阴性。而 FH+/- KO 大鼠同一部位的肾小管上皮细胞的区域 p53 的免疫结果却为阳性。对 Sox9 基因进行免疫染色的载玻片上显示出的差异更明显。对照组大鼠的肾小管上皮细胞呈阴性或弱阳性,而 FH+/- KO 大鼠同一部位的肾小管上皮细胞却呈 Sox9 表达强阳性。
图 7
近年来,FH 基因的研究一直是一个热点问题。据报道,来源于转移性遗传性乳头状肾细胞癌2型的 NCCFH1 细胞系中的 FH 基因突变会导致葡萄糖依赖性的生长和氧化磷酸化受损,这与 Warburg 效应相一致。临床研究表明 FH 基因突变会导致 Reed 综合征,这是一种常染色体的显性遗传疾病,可能代表了遗传性病变。近年来有研究表明,FH 基因突变可能会诱发肾细胞癌变,提示该基因可能具有抑癌作用。在该研究中,研究人员对 FH 基因敲除大鼠的肾组织进行了组织学和免疫组织化学的检查。组织学检查发现 FH+/- KO 大鼠的肾小球周围存在明显的肾小管上皮细胞的渐变性病变,并且这些细胞中的 Ki67、p53 和 Sox9 表达均较高。这些发现可以解释血液生化检查结果中所观察到的肾功能障碍。
综上所述,研究人员成功地建立了一个 TALEN 介导的 FH+/- 敲除大鼠模型,并证明纯合的 FH 敲除大鼠是胚胎致死的。FH+/- KO 大鼠会导致组织和原代细胞中 FH 基因的转录水平和蛋白表达水平的降低,并且 FH+/- KO 大鼠产仔数减少,体重增加。另外,血液学检查显示 FH+/- KO 大鼠存在着不同程度的造血和肾功能障碍。总的来说,研究人员的研究结果表明这种 FH+/- KO 大鼠模型在体内代谢紊乱和肿瘤发生的研究中具有非常重要的潜在价值。
本研究中所使用的 FH+/- 基因敲除大鼠是在 SD 大鼠的背景下由 TALEN 技术构建而成的,相应的 TALEN 构建试剂盒和相关的技术支持由北京唯尚立德提供。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验,已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型,同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台,欢迎您致电咨询。