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2021-03-03

天津大学物理系张晓东教授的课题组在 J Biomed Nanotechnol 发表了研究论文:

“Naturally-Derived PHA-L Protein Nanoparticle as a Radioprotector through Activation of Toll-Like Receptor 5”(https://dx.doi.org/10.1166%2Fjbn.2019.2665)

研究了一种新型的 PHA-L 蛋白质纳米颗粒。

此种纳米颗粒可以克服小分子和无机纳米颗粒作为辐射保护剂的局限性,具有较高的生物相容性、优异的药代动力学和提高γ射线照射存活率等一系列优点。通过进一步的研究,研究者们发现 PHA-L 蛋白可以保护细胞免受辐射的损伤,在进一步的机制研究中,实验人员发现 PHA-L 蛋白可与 TLR5 受体结合,激活 TLR5-NFκB 通路,从而通过机体的免疫反应保护受辐射的细胞。

众所周知,高能射线在医学诊断和治疗中可以使患者受益,但同时也会对 DNA 等生物分子造成重大的损伤,并且会产生大量的自由基,不可避免地会导致许多的副作用。而小分子的辐射保护剂可以用来保护受电离辐射的健康组织和整个身体,但缺点是,这些小分子保护剂在体内的循环时间总是很短。

无机的纳米粒子在辐射保护中也表现出很明显的保护作用,然而由于在体内与生物机体的相容性不够理想,并且它们所含的重金属成分也大大地危害了它们的转化潜力。在新的研究中,作者报道了一种新型的蛋白质纳米颗粒,不但有组织相容性高和代谢动力学优异等特点,蛋白纳米颗粒还可以清除体内过量的活性氧,并防止辐射所引起的造血和胃肠道损伤,并将受辐照小鼠的存活率提高到 70% 左右。

对这一过程的作用机制的详细研究表明,PHA-L 蛋白纳米颗粒可以在体内外靶向激活 TLR5 受体,从而通过调节机体的免疫反应来保护受辐射的细胞。更重要的是,PHA-L 蛋白质纳米颗粒可以被高效地清除,因而所引起的毒性反应相当地微不足道。

长期以来,盆腔和腹部的肿瘤是影响胃肠道功能的常见恶性肿瘤。由于肿瘤体积庞大,容易扩散至腹部其他的器官和淋巴系统,目前放射治疗已成为治疗盆腔和腹部癌症的常规方法。因此,急需寻找一种新的治疗方法来减轻辐射所造成的损伤。

辐射可导致隐窝上皮细胞的直接死亡,从而引发过度的炎症反应。具体来说,辐射所放射出的高能量光子,可以为细胞中的分子提供能量,将原子中的电子从内轨道激出,从而产生大量的活性自由基。这些自由基与邻近的分子快速反应,导致 DNA、脂类和蛋白质等生物分子的化学键断裂和氧化,从而对细胞和组织造成损伤。

多种氧化还原性的分子和纳米粒子对辐射损伤均有保护作用,小分子类的抗氧化剂通过减少自由基对γ射线所造成的损伤具有保护作用。然而,这些小分子抗氧化剂在血液循环中半衰期短,并伴有不良的神经毒性。尽管无机纳米材料可以延长在血液循环中的时间,但在防止造血和胃肠系统的辐射损伤方面也仅显示出有限的作用。

在研究中,研究人员报道了来源于植物的 PHA-L 蛋白纳米颗粒对辐射损伤小鼠模型的治疗效果,它可以抑制对辐射最敏感的器官之一的肠粘膜中细胞的凋亡。此外,它还减少了辐射所产生的自由基。PHA-L 蛋白纳米颗粒具有低毒、低残留等特点,有望用于放射性肠病和转化医学的治疗。

PHA-L 是从大红豆中提取的一种蛋白质,在透射电子显微镜下,它以颗粒状的形式存在,平均直径约为 6.8nm(图1a),流体动力学的尺寸约为 9.6nm,非常接近预测的 126kDa 分子量(图1c)。然后研究人员检测了 PHA-L 蛋白的细胞毒性,发现 PHA-L 对 CHO-K1 细胞的活性没有影响,即使给药浓度达到 100μg/ml。

在极高的浓度(如300μg/mL)下,48h 后细胞活性略降至 86%,表明细胞毒性极低。在相对较低的浓度(10、50和100μg/mL)下,PHA-L 对辐射造成的细胞死亡具有剂量依赖性的保护作用(图1d)。PHA-L 处理的细胞和未处理的细胞在辐射下的存活率均显著降低,但 PHA-L 处理的细胞在辐射下的存活率仍是高得多(图1e)。

用流式细胞仪分别测定经 PHA-L 处理和未经 PHA-L 处理的受照细胞内的活性氧水平。正如预测的那样,辐射导致自由基水平显著升高,但 PHA-L 处理显著降低了辐射诱导的活性氧的产生(图1f)。荧光成像分析显示辐射引起的活性氧的产生明显受到抑制(图1g,1h,1i)。

图 1
为了进一步探讨 PHA-L 的保护机制,研究人员研究了它对辐射有保护作用的细胞表面受体(如TLR5)激活的影响。将 hTLR5 基因和碱性磷酸酶报告基因 SEAP 共转染到 HEK293 细胞中,构建 HEK-BlueTM hTLR5 细胞。将 SEAP 报告基因置于可诱导的 NF-κB and ap-1 启动子下。TLR5 基因的配体可以激活 NF-κB 和 AP-1,从而诱导 SEAP 的产生。
在 PHA-L 的不同剂量(10,50和100μg/mL,图2a)的刺激下,TLR5活性增加,对 HEK-BlueTM hTLR5 细胞中 TLR5 活性的激活,有剂量依赖性(1.81-,2.64-,2.94倍)。然而,PHA-L 处理并没有改变 TLR5 在阴性对照细胞中的表达水平,提示 PHA-L 影响的是 TLR5 受体的活性。事实上,在转染荧光素酶报告基因的细胞中,PHA-L 的刺激显著提高了荧光素酶的活性(图2b),表明 PHA-L 可能是 hEK293细胞的 TLR5 信号的激活剂。
为了确定 PHA-L 是否也影响 TLR5 的表达,研究人员还用不同浓度的 PHA-L 刺激人外周血中的单核细胞,并通过 RT-PCR and WB 分析检测细胞中的 TLR5 mRNA 和蛋白的水平。RT-PCR(图2c,e)和 WB(图2d,f)的结果显示,细胞中的 TLR5 mRNA(图2c,e)和蛋白(图2d,f)受 PHA-L 的正向调控。综上所述,PHA-L 不仅能激活 TLR5 的受体,而且还能诱导 TLR5 在免疫细胞中的表达。
图 2
为了进一步了解 PHA-L 的保护机制,研究人员研究了 PHA-L 对肺、肝等主要器官细胞功能和凋亡的影响。尽管 PHA-L 在辐射后的1天内对肺和肝组织中的 SOD 水平没有显著影响,但在辐射后的第7天,肺和肝组织中的 SOD 水平则显著地得以恢复(图3 b c)。类似地,PHA-L 的处理导致在辐射后的第7天在肺和肝中的 MDA 的水平显著下降(图3d,3e)。
由于肠道是对辐射最敏感的器官之一,研究者们研究了 PHA-L 对辐射所造成的肠道细胞凋亡的影响,对处理后组织的染色显示了辐照所导致的肠道细胞的凋亡情况(图3f-i)。健康小鼠的切片未见红斑,细胞凋亡信号可忽略不计,辐射后的小鼠出现了大量的红斑,而 PHA-L 处理后的小鼠也未见明显的红斑,显示了 PHA-L 对辐射所造成的细胞凋亡有明显的保护作用(图3f)。
图 3
为了确定 TLR5 在 PHA-L 介导的保护作用中作用,研究人员通过 CRISPR/Cas9 技术制备了 TLR5-/- 敲除小鼠,并进行了相似的验证实验。TLR5 基因敲除后影响 PHA-L 治疗辐射损伤的示意图见图4a。图4b显示,TLR5基因被敲除了8个bp的碱基。WB 结果显示,TLR5 蛋白在 TLR5 基因敲除的小鼠中的表达被成功抑制(图4c)。
与 PHA-L 处理后的显示出显著保护作用的野生型小鼠相比(图4d),PHA-L 对 TLR5-/- 基因敲除的小鼠几乎没有任何保护作用(图4d)。所有 TLR5 KO 小鼠在辐射后都死亡,无论是否有 PHA-L 的处理。在 TLR5 敲除小鼠中,PHA-L 处理同样不能抑制辐射诱导的骨髓 DNA 含量和 BMNC 细胞数量的减少(图4e,4f)。这些结果表明 TLR5 是 PHA-L 的一个特异性受体,可以提供对辐射所造成的损伤的保护。
图 4
之后,研究人员使用用 Cy3 标记的 PHA-L 蛋白纳米颗粒,通过腹腔注射来评估其药代动力学和在体内的毒性。结果显示,PHA-L 蛋白纳米颗粒对小鼠的生长没有明显的不良影响(图5a),并且在给药48小时内通过肾排泄进行清除,清除率约为70%左右(图5b)。PHA-L 蛋白纳米颗粒的血液循环半衰期约为4h左右(图5c),远远长于 Amifostine 等小分子。在体内,它主要积累在脾脏,但发现在肾脏中也有,肺和其他器官也有部分富集(图5d),支持对这些器官的保护作用。结果显示,与大多数已报道的金属性的纳米颗粒相比,PHA-L 蛋白纳米颗粒显示出了比较理想的药代动力学特性和排泄特征。
图 5
综上所述,研究人员证明了 PHA-L 蛋白纳米颗粒在体外对辐射诱导的细胞死亡具有剂量依赖性的显著保护作用,在体内对辐射诱导的肠病和小鼠死亡也具有明显的保护作用。机制上,PHA-L 通过减少自由基的产生和维持造血功能来发挥保护作用。这种效应还依赖于 TLR5 功能的激活,这支持了 TLR5 的配体可以作为保护剂用于辐射所造成损伤的临床治疗的作用。
本研究中所使用的 TLR5-/- 基因敲除小鼠由北京唯尚立德提供,该小鼠在 C57BL/6 的背景下通过 CRISPR/Cas9 技术构建而成的。北京唯尚立德生物科技有限公司是拥有多年的基因编辑经验,已为数千名科研工作者及工业客户成功定制基因编辑模型,同时搭建了完善的基因工程动物创制平台、动物表型分析和实验技术服务平台、动物模型种源交流平台、实验动物繁育平台,欢迎您致电咨询。