T7 体外转录试剂盒
货号 | 规格 | 价格 |
#VK010 | 30次 | 1288元 |
产品组成：
编号 | 组成 | VK010-30T |
1 | T7 RNA Polymerase Mix (5U/μL) | 300U |
2 | rNTP(100 mM,rATP/rUTP/rCTP/rGTP) | 60μL |
3 | 10X Transcription Buffer | 60μL |
4 | Stop Solution | 500μL |
5 | DNaseI (2U/μL) | 60U |
6 | DEPC H2O | 1ml |
注意： 收到试剂盒后，使用前请离心，避免试剂滞留在离心管盖上。
保存与运输
产品于-20℃保存，避免反复冻融；采用蓝冰运输。
说明
T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，以上游带有T7启动子的目的基因的线性化DNA为模板体外快速转录成相应的RNA。 T7 RNA 聚合酶启动子同源序列：
+1
T7（5’→3’）TAATACGACTCACTATAGGG
G（+1）是RNA转录的起始位点，正义RNA合成要求目标序列置于启动子的下游。
应用
1． CRISPR系统中的gRNA转录，转录的gRNA可以快速进行体外准确剪切，或者显微注射。
2． siRNA的合成。
使用步骤
一、转录模板DNA的准备
可以采用下面两种方式之一来准备体外转录模板DNA：
1、线性化的质粒DNA：含有T7 RNA聚合酶启动子且方向正确，在目的基因下游切割使质粒DNA线性化；
2、PCR产物：T7 RNA聚合酶启动子必须定位在目的基因的上游。
二、RNA的体外转录
反应体系：
10xTranscription Buffer | 2 μL |
rNTP (100 mM) | 2 μL |
T7 RNA Polymerase Mix | 2 μL |
template DNA（≥100ng/μL） | 1μL |
DEPC H2O | up to 20 μL |
以上混合后，37℃反应1～2小时。
反应结束后，加入1 μL DNase I，37℃反应30分钟。
三、RNA的回收与提取：
1、加入115μL DEPC水，15μL Stop Solution混匀后，加入2倍体积（300μL）的无水乙醇（自备），充分混匀后，-20℃冻存30min以上（若RNA小于300nt, -20℃冻存3小时以上）。
2、13000rpm 4℃离心20 min，去除上清保留沉淀。
3、加入300μL的70％冷乙醇清洗（自备，注意用DEPC水配制），13000rpm 4℃离心15 min，去除上清保留沉淀，待乙醇晾干后，加入DEPC水溶解RNA沉淀。
4、测量RNA浓度，直接用于后续实验, 或者-80℃保存待用。
注：以上的操作请全部购买和使用RNase free 的枪头及EP 管，ddH2O用DECP处理。