T7 体外转录试剂盒

产品组成：

注意： 收到试剂盒后，使用前请离心，避免试剂滞留在离心管盖上。

保存与运输
    产品于-20℃保存，避免反复冻融；采用蓝冰运输。

说明
    T7 RNA 聚合酶对T7噬菌体启动子具有高度的特异性，以上游带有T7启动子的目的基因的线性化DNA为模板体外快速转录成相应的RNA。 T7 RNA 聚合酶启动子同源序列：

                                                                                       +1
                          T7（5’→3’）TAATACGACTCACTATAGGG  
          G（+1）是RNA转录的起始位点，正义RNA合成要求目标序列置于启动子的下游。

应用
    1． CRISPR系统中的gRNA转录，转录的gRNA可以快速进行体外准确剪切，或者显微注射。
    2． siRNA的合成。

使用步骤
一、转录模板DNA的准备
    可以采用下面两种方式之一来准备体外转录模板DNA：
    1、线性化的质粒DNA：含有T7 RNA聚合酶启动子且方向正确，在目的基因下游切割使质粒DNA线性化；
    2、PCR产物：T7 RNA聚合酶启动子必须定位在目的基因的上游。
二、RNA的体外转录
    反应体系：

以上混合后，37℃反应1～2小时。
反应结束后，加入1 μL DNase I，37℃反应30分钟。

三、RNA的回收与提取：
1、加入115μL DEPC水，15μL Stop Solution混匀后，加入2倍体积（300μL）的无水乙醇（自备），充分混匀后，-20℃冻存30min以上（若RNA小于300nt,  -20℃冻存3小时以上）。
 2、13000rpm 4℃离心20 min，去除上清保留沉淀。
3、加入300μL的70％冷乙醇清洗（自备，注意用DEPC水配制），13000rpm 4℃离心15 min，去除上清保留沉淀，待乙醇晾干后，加入DEPC水溶解RNA沉淀。
4、测量RNA浓度，直接用于后续实验, 或者-80℃保存待用。

注：以上的操作请全部购买和使用RNase free 的枪头及EP 管，ddH₂O用DECP处理。