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多基因片段快速拼接克隆试剂盒


产品组成:


组成

货号

VK009-10T

VK009-30T

Easy Assembly Mix(Mix)

Easy assembly 酶与反应buffer混合物;7.5 μL/管

VK009-1

10管

30管

Positive control(PC)

阳性连接DNA片段和载体混合物(10μL/)

VK009-2

 


注意收到试剂盒后,使用前请离心,避免液体滞留在离心管盖、管壁上。


保存条件: -80℃保存一年;或-20℃保存两个月。请将产品于-80℃保存,避免反复冻融

Easy Assembly反应示意图:
    Easy Assembly 通过体外重组方法一步完成多个(2-6个)DNA片段无缝拼接连接 (见下图)。 Easy Assembly是一种新颖的分子克隆方法,不需要传统克隆方式的酶切连接,仅需要15-70bp(建议50bp)的同源接头,并可以随意修改接头部位的序列,使得DNA克隆方便快捷,连接更加精确,且反应时间短。

Easy Assembly的优势:
1. 实现多个DNA片段同时拼接
2. 拼接DNA片段大小范围宽(260bp-10Kbp),实现大片段DNA的克隆
3. 试验操作简单,避免了DNA酶切、回收、连接等分子克隆操作,操作时间大大缩短,约半小时可完成反应
4. 反应效率高

适用范围:
载体≤15k;连接片段长度 260bp-10Kbp; 连接DNA片段数目:≤10
接头长度:15-70bp,40-50bp最佳。
DNA片段推荐浓度: 0.002-0.010 pmol/片段。
浓度计算:pmol= DNA质量ng×1000/(碱基对数目×650D), 例如,50ng 5kb的双链DNA为0.015pmol。  

实验步骤:
1. 分别通过PCR或者酶切准备进行拼接的DNA片段,定量。
2. 取一支easy Assembly mix,离心,避免液体残余管盖、管壁上,放置在冰上。
3. 将各个DNA片段按等摩尔量混合,取总量2.5μl的DNA片段,加入到一支easy Assembly mix管中, 混匀。
4. 立即置于50℃(可在PCR仪上进行),反应30min-60min后,然后进行DNA的E.coli转化, 复苏,涂板。

注意事项:
1. 加入的DNA片段应为等摩尔量。
2. 加样过程于4℃操作。
3. 当出现下列情况建议使用2倍反应体系:连接DNA片段多于5段, 或者单片段长度大于6k, 接头长度小于15bp或大于50bp,反应片段摩尔量低于0.0002pmol。
4. 若接头大于70bp, 建议适当延长反应时间。
5. 多片段反应时,接头应避免出现重复序列,或者拼接片段中除接头外尽量不要再有接头序列,由于反应原理是体外同源重组,将可能出现这些同源序列的意外拼接。
6. 建议使用DH5α感受态细胞进行转化。
7. 建议转化后复苏45min-1h。

同源接头设计例子:
下面序列是需要拼接的相邻DNA序列,分别用红色字体与黑色字体标示。所以接头的同源序列就直接取红色与黑色字体的交接处的DNA序列:

GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCA

CTCTGTGGCACTTTCCAATTTCAGACTCTGATCCGGACACTCTTACAGGGNNNNNNNATGCTGGAGAAGTTCTGCAACTCTACTTTTTGGAAT

TCCTCATTCCTGGACAGTCCGGAGGCAGACCTGCCACTTTGTTTTGAGCAAACTGTTCTGGTGTGGATTCCCTTGGGCTTCCTATGGCTCCTG

GCCCCCTGGCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCAAACTCTATCTTGCTAAGCAGGTATTCGTTGGTTTT

CTTCTTATTCTAGCAGCCATAGAGCTGGCCCTTGTACTCACAGAAGACTCTGGACAAGCCACAGTCCCTGCTGTTCGANNNNNNNNNNTGATC

TTTTCAGCATTTTCAGAAAATAATGAGTCATCAAATAATCCATCA


因此,接头同源序列可以加在引物上,如下:
片段1正向引物:
根据上一段拼接的序列而定
片段1反向引物: TGGTGGTAGAGGATCTCTTGGTCCTGGATTTATACACGTGGAGAAGCTGC

片段2正向引物:GCAGCTTCTCCACGTGTATAAATCCAGGACCAAGAGATCCTCTACCACCA
片段2正向引物:根据下一段拼接的序列而定
片段1 和片段2的PCR产物,再加上其他DNA片段将可以通过Easy Assembly Cloning Kit 无缝拼接在一起了。